Name: רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למדו את שיטת ACT לקביעת גורל רקמות ב-Xenopus laevis באמצעות שתלת כיפות חיות מושרות. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת גנים על התפתחות עוברים ויצירת רקמות אקטופיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי למנוע עיוורון (פיתוח קריירה פרסים MEZ ו ASV ו מענק חופשית מחלקת עיניים), את מטילדה א זיגלר קרן (MEZ ו ASV) ואת העין לאומי / NIH (MEZ , מענקים R01EY015748 ו R01EY017964).

חלק א הקמה עבור Assay ACT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת רנ"א כתרים להזרקה כפי שהוצע על ידי היצרן, באמצעות פנול שלהם: שיטת טיהור כלורופורם (למשל mMessage mMachine קיט; Applied Biosystems / Ambion, אוסטין, טקסס). קידוד RNA חלבון פלואורסצנטי משמש נותב. אנו לתמלל או חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) או mCherry 5 cDNA, שהוא וקטור ביטוי pCS2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי טיפים ליצירת זכוכית קוני באמצעות חולץ micropipette. אנו משתמשים סאטר micropipette פולר, P-97 (סאטר מכשירים, Inc, Novato, CA), כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות סטרילי בטבלה 1 מתוך 10 השתנה X של מארק Ringer של (MMR) פתרון המניות (10 mM MgCl 2: 20 מ"מ KCl: 20 מ"מ CaCl 2; 50 HEPES מ"מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסנים ב RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד האשכים מן צפרדע זכר לחנות רקמה על 4 ° C בתמיסה סטרילית של 1X MMR / גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין סולפט; BioWhittaker, חתול # 17-518Z). ניתן לעשות זאת עד שבוע לפני תחילת הניסוי, אבל זה מאבד את יעילותו לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ההטלה (1X: 150 mM NaCl, KCl mM 2.62, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 מ"מ Trizma בסיס, 2.62 mM NaHCO 3 ו - 2.75 mM MgSO 4; מותאם pH 7.6) ניתן גם מניות 8X, אשר ניתן לאחסן 4 ° C למשך עד שבועיים. הערה: להיזהר זיהום בפתרון זה, כמו זה ישפיע על איכות הביצים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צלחות ההזרקה. כדי לעשות זאת, להמיס agarose 1% MMR 0.4X במיקרוגל, מוסיפים 6 ~ פתרון נמס לתוך 60 מ"ל agarose צלחות מ"מ, לגולל בעדינות עובש אלסטומר (איור 1) על גבי פתרון כדי למנוע בועות ולתת להתקרר למשך כ 20 דקות RT. כדי לקבוע את מספר צורך לשקול מספר תנאים ניסויים (למשל 1, YFP; 2, YFP noggin +) ואת מספר העוברים המושתלים מארח הצורך. על הניסויים שלנו, אנחנו מייצרים לפחות 20 עוברי מארח המושתלים עבור כל תנאי הניסוי. ב 18-19 ° C, עוברים יהיה בשלב 15 במשך כשעה. אם זה לוקח שעה לבצע 20 השתלות, אז שתי נקודות זמן הפריה יש צורך, בהנחה עוברים מארח לקבל את כל ההשתלות. לכן, ארבע מנות הזרקה יהיה צורך (2 תנאים exp x 2 נקודות זמן הפריה = 4). אחסן את הלוחות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור בידוד כובע צלחות באמצעות 1% agarose + 0.7X MMR עם תבניות כמו צלחת ההזרקה. בצע את אותו מספר של בידוד כובע כמו צלחות זריקה ועוד אחד זמן נוסף לכל נקודה הפריה (4 + 2 נקודות זמן הפריה = 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק נקבות עם 500 יחידות גונדוטרופין כוריוני אנושי מאוחר יותר באותו יום יום לפני microinjection. חנות נקבות ב 16-18 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> חלק II. RNA Microinjection עוברים Xenopus laevis א הכנה microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נקבה המושרה הורמונלי ומכניסים אותם טנקים בודדים המכיל 1X פתרון ההטלה (ELS). הערה: אנחנו לא משתמשים בביצים, כי כבר ב ELS יותר משעתיים כמו איכות הביצים מצטמצם. לכן, כשעה לפני הפריה חוץ גופית, אנו לזרוק את כל הביצים מהטנק כך ביצים רק טרי נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המחט על ידי microinjection תולשת את קצה להשיג בקוטר 25-35 מיקרומטר. מניחים את המחט אל picoinjector לכייל אותו כך שהוא מחלק 10 NL לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר באינקובטור עד 14 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנקבות יש הטילו ביצים במשך כשעה, להסיר את הביצים מהטנק באמצעות פיפטה להעביר ולהכניס אותם לתוך 60 מ"מ צלחות פטרי. הסר כמו ELS הרבה מן הביצים ככל האפשר ולהחליף MMR 1X. הביצים יכול להיות מופרית מיד או להישאר MMR 1X עד שעה. עבור assay ההשתלה, עדיף להפרות שתי מנות, 80% מלא בשכבה אחת של ביצים עד שלוש קבוצות נפרדות בסביבות 11:00, צהריים 01:00. לאחר ההזרקה, הם יוצבו על 14 מעלות צלזיוס, כך שהם יגדלו בשלבים הרצוי עבור בידוד כובע (שלב 8.5-9) וכן השתלה (שלב 15; לראות חלק I, # 6 לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את האיכות של האשכים, אנו מבצעים הפריה הבוקר המוקדמות (~ 08:00), אשר מאפשרת לנו לחלץ מן האשכים הגברי אחר אם הזרע הראשון אינו בר קיימא. הערה: אנו homogenize ~ 0.25 האשכים ב 1 מ"ל 1X MMR ולהוסיף כ 5-7 טיפות לכל צלחת של ביציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנה להפרות את הביצים עם האשכים הומוגני וגם, כעבור שעה, להסיר את המעיל ג'לי על הביצים באמצעות דה ג'לי פתרון (164μl 1M DTT + 10 מ"ל 1M טריס, pH 8.8 עד 50 מים nanopure autoclaved מ"ל). חכו עד שהם מגיעים שני תאים בשלב להתחיל מיון, אשר לוקח בערך 2 שעות 18 ° C או 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (22 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש transfאה פיפטה, עוברים מיון פיגמנט אחיד לחלק באופן שווה, כפי שמוצג כובע החיה שמאל באיור 3, לתוך הבאר של צלחת זריקה מלא Ficoll + 0.4X MMR 6%. </li></ol> ב Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיחה Parafilm מעל מכסה 60 מ"מ צלחת פטרי. פיפטה 2 μl של הדוגמה הראשונה RNA שלך על Parafilm ואת לשאוב באמצעות PLI-100 כדי למלא את מחט הזריקה שלך. הקפד לבדוק כי המחט עדיין מחלק 10 NL המדגם לפני תחילת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 20-30 שני תא עוברי בשלב (שניהם בלסטומרים) עם 500 עמ YFP RNA בצלחת אחת הגן העניין שלך (למשל 20 pg noggin RNA) בתוספת YFP RNA בצלחת נוספת 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100-200 הלא מוזרק עוברים לכל נקודת זמן בצלחת עוד זריקה עם פתרון Ficoll. העבר אותם פנימה והחוצה של החממה באותו זמן כמו עוברי מוזרק. אלה המארחים כדי לשמש חלק ד '. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, דגירה כל העוברים על 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן. </li></ol> חלק III. בודד כמוסות חיים מעוברים מוזרק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה בשעות הבוקר המוקדמות לשלב עוברי. נקודת הזמן המוקדם אמור להיות בשלב 9. הסר את אלה שלא שרדו. המשך בשלבים הבאים לעבוד עם נקודה בכל פעם בקבוצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון Ficoll מהצלחת כל ולהוסיף MMR 0.7X בחזרה / פתרון גנטמיצין. כדי בצלחת הבידוד המכסה, מוסיפים כמות נדיבה של פתרון ה-MMR / גנטמיצין 0.7X. לעקור עוברים מצלחת זריקה שלהם בארות באמצעות פיפטה להעביר מקום את התבשיל מוכן טרי הבידוד המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד כמוסות חיה פתרון 0.7X MMR + גנטמיצין, שמירה על 2 או 3 עוברים שלם עבור הבימוי. או Gastromaster, מצויד קצה צהוב התכופפה 400 מיקרומטר, או זוג 5 מלקחיים חדה במספר ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמוסות בחזרה 14 ° C החממה עד למחרת. עוברים המארח יש להסיר מן האינקובטור באותו זמן כמו כובעים כדי לשמור אותם בשלב התפתחותי זהה רקמות התורם. </li></ol> חלק ד '. השתלה של כמוסות על האגף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כובעים עוברים מנקודה זו הפעם הראשונה מתוך 14 ° C החממה בשלב עוברי. מיון אחיד עבור ניאון חיובי כמוסות צהוב או אדום, תלוי הזריקו נותב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת כובעים להסיר להכפיל את מספר השלב 12-13 עוברים לצלחת הזרקת מוכן טרי עם 0.7X MMR / פתרון גנטמיצין. עם חדות מלקחיים # 5, להסיר את הקרום vitelline מכל אחד. העברת אותם בצלחת עם כובעים, אבל להיות זהירים. ללא קרומים vitelline שלהם, עוברים במהירות לנתק את פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש (קצה צהוב, חוט 200-250μm כפופות, הגדרת הגבוה ביותר) gastromaster או # 5 מלקחיים, להסיר 200 מיקרומטר מרובע בצד של העובר בשלב 14-15 (איור 3). לאחר מכן, לחתוך כובע במחצית (עם gastromaster או # 5 מלקחיים) והמקום רקמות החור שנעשו בעובר המארח. סובב את העובר נגד היטב כדי לאפשר ריפוי. האם זה כמו עוברים רבים ככל שאתה יכול בזמן שהם בשלב 15. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר בדרך כלל לרפא בתוך 30 דקות. הסרת התאים המתים (לבן) בתנועה הברשה עדינה עם מלקחיים # 5. לגדל אותם 18 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, עוברים מיון עם רקמה, fluorescently שכותרתו המושתלים. שים אותם בחזרה 18 ° C לגדול עד לשלב 42-43. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות tricaine. בשלב זה, אתה יכול לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. לאחר שתסיים, לתקן, סעיף ו immunostain או לבצע הכלאה באתרו באמצעות סמנים עבור רקמות העניין שלך. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עיצוב של פרספקס ליציקת את התבנית אלסטומר משמש להכנת מאכלים מחזיק העובר. 38 x 38 עגול פינות מ"מ מרובע (~ 5 מ"מ עמוק) כבר מנותב מתוך פיסת פרספקס כי הוא 50 x 50 מ"מ מרובע ו 25 מ"מ עובי. בחוזר, בארות מחולקת באופן שווה (בקוטר 1.5 מ"מ) כבר קדחו 1 מ"מ עמוק לתוך הפלסטיק. כדי להפוך את התבנית אלסטומר עבור microinjection את הכלים, אנחנו מזג אלסטומר Sylgard לתוך פרספקס ואיפשר לו לגבש, לפי הוראות היצרן. עובש זה אלסטומר משמש לייצור הזרקת ובידוד צלחות כובע. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. כובע מיון בעלי חיים לפני השתלת חשוב, כביטוי יכול להשתנות. כובע בעלי חיים בצד שמאל מבטא mCherry באופן שווה על פני רקמת בעוד explant בצד ימין יש ביטוי מחוצ'קנים, ייפסל. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Tadp מארחOLE פיתחה מבנה העין כמו על האגף שלו מן התאים המושתלים כובע בעלי חיים. תמונה פלורסנט כבר overlayed על התמונה brightfield.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

בסרטון זה, יש לנו הפגינו הגרסה שלנו של טכניקות קלאסיות בשימוש על ידי ביולוגים Xenopus, שאנו מחדש ליצור את כובע חיה assay להשתלה. בטמפרטורת החדר, עוברים Xenopus לפתח מהר מאוד שלבים 9 ו -15. על ידי הצבת אותם על 14 מעלות צלזיוס, התפתחות העובר הוא האט השתלות רבות יותר ניתן לבצע ניסוי אחד. אם יש צורך לגדל את העוברים לשלבים מבוגרים יותר (&gt; 42 / 43), ואז אנו ממליצים להשתמש מהונדס ונוס חיות YFP, שכן הזריקו ניאון האות דועך חלבון הראשנים יותר. השתמשנו זה assay לקבוע כי ...

<table><tbody><tr><td>ערכה mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קפילריים מבורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ x קוטר פנימי 0.5 מ"מ)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות של Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין סולפט [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>ערכה של Sylgard/elastomer במשקל 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>צלחית פטרי מפוליסטירן 60 x 15 מ"מ</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>מערכות מיקרו-הזרקה מסוג Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור ECHOtherm של Torrey Pines Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת העברה</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumostar #5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (act) assay ב xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

חלבונים רבים משחקים תפקיד כפול ההתפתחות העוברית. אלה המווסתים את גורל קביעת תא ברקמה מסוימת יכול להשפיע גם על פיתוח של אזור גדול יותר של העובר. זה הופך את הגדרת תפקידה רקמה מסוימת קשה לנתח. לדוגמה,<em&gt; Noggin</em&gt; Overexpression ב<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים גורמת להרחבת האזור הקדמי כולו, כולל העין<sup&gt; 1,2</sup&gt;. מתוך תוצאה זו, לא ידוע אם noggin ממלאת תפקיד ישיר בקביעת העין או על ידי גרימת הרחבה של רקמה עצבית, noggin משפיע בעקיפין היווצרות העין. אחרי זה פנוטיפ מורכבים עושה לומד תפקיד עין ספציפי שלה בקביעת גורל התא קשה לנתח. פיתחנו assay כי מתגבר על הבעיה הזו. ניצול של הטבע pluripotent של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; בעלי חיים כובע<sup&gt; 3</sup&gt;, פיתחנו assay לבחון את היכולת של המוצר גן (ים), כמו<em&gt; Noggin</em&gt; או את שדה עין גורמי תעתוק (EFTFs), להפוך כמוסות לרקמה מסוימת או סוגי תאים ידי השתלת רקמה זו על הצד של העובר<sup&gt; 4</sup&gt;. אמנם מצאנו גם חלבון noggin טיפול או אוסף של גורמי שעתוק יכולים לקבוע את גורל התא רשתית כמוסות חיה, הליך זה יכול לשמש כדי לזהות מוצר הגן (ים) מעורב ציון ברקמות אחרות.

בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף לפיתוח<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים על מנת לקבוע אם רקמת נקבע.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

חלבונים רבים ממלאים תפקיד כפול בהתפתחות העובר. חלבונים המווסתים קביעת גורל תאי ברקמה ספציפית עשויים להשפיע גם על ההתפתחות...

המטרה הכללית של בדיקת ה-A CT היא לבחון האם גן או גנים בעלי עניין יכולים להכ direct את הדֶרמה פרימיטיבית (primitive derm) לעבר גורל תאי מסוים. הפרוצדורה מתחילה בביטוי יתר של ה-RNAs המקודדים לגן דות (reporter gene) פלואורסצנטי ולגן או לגנים בעלי העניין בעוברי XUS lavis מתפתחים. השלב הבא הוא להוציא באמצעות דיסקציה את כיפת החיה (animal cap) או את האקטורם פרימיטיבי (primitive odum) המבטאים את ה-RNAs בביטוי היתר ולגדל אותם עד לשלב 15.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הסרת רקמה מהצד של עובר מאכסן בשלב 15. השלב הסופי הוא השתלת מחצית מרקמת כיפת התורם אל צדו של עובר המאכסן והגדלתו לשלב 42 עד 43. התוצאות מראות היווצרות של רקמה אקטופית, כגון מבנים דמויי עין, באמצעות חיתוך וצביעה אימונוהיסטוכימית לסממנים ספציפיים לרקמה.שלום, אני אנד סין מהמחלקה an Ophthalmology באוניברסיטת Upstate Medical University. היום אראה לכם הליך שאנו מכנים בדיקת השתלת כיפת בעל חיים (animal cap transplant assay), שפיתחתי בשיתוף פעולה עם מייק סובר. אנו משתמשים בבדיקה זו בשתי המעבדות שלנו כדי לחקור את הגנים המספיקים ליצירת עין.אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את ה-cap RNAs להזרקה; בצעו תמלול של noggin או גן אחר שמעניין אתכם, ושל YFP שישמש כסמן. הכינו גם את התמיסות המבוססות על MMR, תמיסת אם של eight x egg laying solution ואת המחטים להזרקה לעוברי הדגים.תבנית אלסטומר מותאמת אישית משמשת להכנת צלחות להחזקת עוברים. הכינו לוח הזרקה אחד לכל תנאי ניסויי על ידי המסת 1% AROS ב-0.4 XMMR במיקרוגל. העבירו כשישה מיליליטר של התמיסה לתוך פלטה של 60 מילימטר.הנח בעדינות תבנית אלסטומר על גבי התמיסה כדי למנוע היווצרות בועות והשאר לקירור למשך כ-20 דקות. בטמפרטורת החדר, הכן לוח בידוד של כיפה אחת לכל תנאי ניסויי, תוך שימוש ב-1%AGROS בתוספת 0.7 XMMR עם תבניות כפי שהודגם זה עתה עבור לוחות ההזרקה. הכן לוחות נוספים עבור כל נקודת זמן.עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף לפרטים על חישוב נקודות הזמן. לאחר מכן בצע בידוד. בדוק אלו מצאפרדע זכר ואחסן את הרקמה בטמפרטורה של 4 °C בתמיסה סטרילית של 1X MMR המועשרת ב-50 µg/mL של Gentamycin.ניתן לבצע זאת עד שבוע לפני תחילת הניסוי, אך שימו לב כי יעילות הזרע פוחתת עם הזמן, בשעות מאוחרות של היום שלפני המיקרו-הזרקה. הגמיזו לנקבות 500 יחידות של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי. הניחו את הנקבות בטמפרטורה של 16 עד 18 מעלות צלזיוס למשך הלילה.כעת הכל מוכן להזרקה מיקרוסקופית למחרת. התחילו בהוצאת הנקבות שהושרתה הורמונלית והעבירו אותן למכלים אינדיבידואליים המכילים XELS אחד. הכינו את המחט להזרקה מיקרוסקופית על ידי גזירת הקצה.כדי להשיג קוטר של 25 עד 35 מיקרומטר, מקם את המחט על ה-PLI 100 pico injector וכייל אותה כך שתפריש 10 ננוליטר לכל הזרקה. הגדר אינקובטור ל-14 מעלות צלזיוס על ידי מיקום המוצא בטמפרטורה נמוכה זו; לאחר הזרקת RNA, התפתחות העובר מואטת וניתן לבצע הרבה יותר השתלות בניסוי אחד. כשעה לפני ההפריה, הוצא את הביצים מהמיכל. לאחר שהנקבות הטילו ביצים למשך שעה נוספת, השתמש בפיפט העברה כדי להוציא את הביצים שהוטלו לאחרונה מהמיכל.שימו לב לא להשתמש בביצים שהו שהו בתמיסת ה-ELS למשך יותר משעתיים. ככל שאיכות הביצים יורדת, הניחו את הביצים בצלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר. הצלחת מלאה בכ-80% בשכבה אחת של ביצים.הסיר כמה שיותר ELS מהביצים והחלף ב-XMMR אחד. הביצים יכולות להישאר ב-XMMR אחד למשך עד שעה. לאחר מכן, בצע הפריה במעבדה (in vitro) של הביצים באמצעות אשכים הומוגניזים.מומלץ לבצע את ההפריה של העוברים בשלוש קבוצות נפרדות, בסביבות השעות 11:00, צהריים ו-1:00, כדי שיוכלו להתפתח לשלב הרצוי: שלב 8.5 עד 9 עבור בידוד ה-cap ושלב 15 עבור השתלה. שעה לאחר הפריית הביציות, הסר את מעטפת הג'לי מהביציות באמצעות תמיסת D jelly Solution Wash עם כמויות רבות של 0.1 XMMR, ולאחר מכן המתן עד שהביציות המופריות יגיעו לשלב התאين השני.כדי להתחיל במיון, הכינו את צלחת ההזרקה הממולאת ב-0.4 XMMR בתוספת 6%F ccal. ברגע שהעוברים מגיעים לשלב שני התאים, השתמשו בפיפטת העברה כדי למיין עוברים בעלי פיגמנטציה אחידה וחלוקה שווה אל תוך באר צלחת ההזרקה.המשיכו למיקרו-הזרקה; מתחו תחילה רצועת פילטר מעל מכסה של פטרי פטרי בקוטר 60 מילימטר. טפטפו 2 µL מדגימת ה-RNA על גבי הביופילם ושאבו. השתמשו במזרק פיקו (pico injector) כדי למלא את מחט ההזרקה.וודאו שהמחט עדיין מחלוקת 10 ליטרים של דגימה לפני תחילת ההזרקה. ה-RNA מוזרק לשני הבלסטרים בתוך עובר בשלב שני של תאים. הזריקו ל-20 עד 30 עוברים, כל אחד עם 500 picograms של Y-F-P-R-N-A, והניחו אותם בצלחת אחת.הזריקו ל-20 עד 30 עוברים נוספים 20 picograms של Nain, RNA המעורב מראש עם Y-F-P-R-N-A, והניחו אותם בצלחת. בנוסף, הניחו 100 עד 200 עוברים שלא הוזרקו לכל נקודת זמן בצלחת הזרקה אחרת המכילה תמיסת FICO. העבירו עוברים אלה אל תוך האינקובטור וממנו באותו זמן שבו מועברים העוברים המוזרקים.אלו הם המארחים שישמשו להשתלת הכובעים לאחר ההזרקה. דגרו את כל העוברים בטמפרטורה של 14 degrees Celsius למשך לילה. חזרו על הפעולה עבור כל נקודות הזמן המתוכננות.בעקבות הדגירה למשך הלילה, ניתן לבודד את מכסה החי (animal cap). יש להגיע בשעות המוקדמות של הבוקר כדי לבצע שלב את העובריים. זכרו להוציא מהמדגרה גם את העובריים המארחים שלא הוזרקו.נקודת הזמן המוקדמת ביותר צריכה להיות בשלב תשע. ראשית, הסירו את העוברים שלא שרדו. המשיכו בבידוד ה-animal caps מהעוברים החיוניים, תוך עבודה עם כל נקודת זמן במנות לכלי בידוד ה-caps.הוסיפו כמות נדיבה של תמיסת 0.7 XMMR בתוספת Gentamycin. לאחר מכן, שפכו את תמיסת ה-fol מכל צלחת המכילה את העוברים המוזרקים והוסיפו בחזרה תמיסת 0.7 XMMR בתוספת Gentamycin. הוציאו את העוברים מבארות צלחת ההזרקה באמצעות פיפט העברה והניחו אותם בצלחת בידוד עם מכסה שהוכנה זה עתה.השתמשו ב-gastro master המצויד בטיפ צהוב מכופף ל-400 micrometers או בפינצטה חדה מספר 5 כדי לבודד את הכפות האנימליות (animal caps) בתמיסת 0.7 XMMR בתוספת Gentamycin. שמרו שני או שלושה עוברים שלמים לצורך קביעת שלב ההתפתחות (staging). לאחר בידוד הכפות האנימליות, החזירו אותן לאינקובטור בטמפרטורה של 14 degrees Celsius יחד עם עוברי המארח עד למחרת, כאשר הכפות מושתלות לצד העוברים המארחים.הוציאו את הכובעים ואת העוברי המארח מנקודת הזמן הראשונה מהמדגרה בטמפרטורה של 14 degrees Celsius, בצעו שלבי התפתחות (staging) לעוברים ומיינו אותם כדי להבטיח כובעים בעלי פלורסצנציה חיובית אחידה. ספרו את מספר הכובעים והסירו אותם. העבירו כמות כפולה של עוברי מארח לצלוחית הזרקה שהוכנה טרי תחת תמיסת 0.7 XMMR בתוספת Gentamycin, באמצעות פינצטה מס' 5 חדה.הסיר את קרום הלנה (Lene membrane) מכל עובירו של המארח. העבר אותם לצלחת עם המכסים, אך היזהר שלא לפגוע במיקום ללא קרומי הלנה שלהם. ניתן להפריד את העוברים במהירות על פני השטח של המים באמצעות gastro master המצויד בטיפ צהוב עם תיל כפוף של 200 עד 250 micrometer בהגדרה הגבוהה ביותר, או באמצעות פינצטה מספר 5.הסר ריבוע של 200 מיקרומטר מצדו של העובר בשלב 14 עד 15. לאחר מכן, שוב באמצעות ה-gastro master או פינצטה מספר חמש, חתוך כיפה לחצייה והנח את הרקמה בחור שנוצר בעובר המאחס.סובבו את העובר כנגד דופן הבאר כדי לאפשר ריפוי. בצעו זאת עבור כמה שיותר עוברים בעודם בשלב 15. חזרו על הפעולה עבור כל נקודות הזמן.העובר מחלים בדרך כלל תוך 30 דקות. באמצעות פינצטה מספר 5, הסירו את התאים המתים הנראים כלבנים בתנועת הברשה עדינה. גדלו את העוברים המותשבים בטמפרטורה של 18 °C במהלך הלילה.לאחר הדגירה למשך הלילה, עבדו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה לדיסקציה כדי למיין עוברים עם רקמה מושתלה המסומנת בפלואורסצנציה. החזירו את העוברים שנבחרו לטמפרטורה של 18 degrees Celsius כדי שיגדלו עד לשלב 42 עד 43. כאשר בעלי החיים מגיעים לשלב הרצוי, הרדימו אותם ב-trica, בחנו אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה לדיסקציה וצלמו אותם.ניתן לקבע, לחתוך ולצבוע אימונו-היסטוכימית את העוברים המושתלים, או לבצע היברידיזציה in situ באמצעות סמנים לרקמה רצויה. להלן תוצאות מייצגות של ראשן מאכסן עם רקמת תורמת המבטאת סמן פלואורסצנטי ו-noggin יום אחד לאחר ההשתלה. שימו לב כיצד הרקמה מתקבצת לכדור בצדו של הראשן.העוברים המארחים שקיבלו רקמת תורם ביקורת המבטאת רק את הסמן הפלואורסצנטי כבר מתחילים לשלב את תאי כיפת החלק העליון (animal cap) בדפם. מספר ימים מאוחר יותר, השבטים שקיבלו תאי תורם המבטאים nain יוצרים מבנים דמויי עיניים בצדם, בעוד שבשבטים שקיבלו את רקמת תורם הביקורת מופיעים תאים פלואורסצנטיים על פני העור. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד לבצע את בדיקת השתלת כיפת החלק העליון ב-Xenopus laevis.בעת ביצוע בדיקה זו, חשוב לזכור להכין את כל הציוד והחומרים לפני תחילת הפרוצדורה באותו היום, כדי שהעוברים לא יתפתחו מהר יותר מהקצב שבו תספיקו להגיע אליהם. זהו כל השלב.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

זהו חלק ראשון מפרוטוקול דגימת קסנופוס מקיף. הרקמות שנדגמו הן חדר הלב, תא המטען העורקי, אונת הכבד השמאלית, כיס המרה, הריאות, הלבלב, הטחול, הגרון, הוושט, הקיבה, המעיים, האשכים, גופי השומן, צינור הביצית, כליות מזווגות, מקלעת סיאטית, עור, תימוס ועין שלמה.

טכניקות יעילות לדגימה מקיפה של רקמות נגישות בקסנופוס בוגר

למדו את שיטת ACT לקביעת גורל רקמות ב-Xenopus laevis באמצעות שתלת כיפות חיות מושרות. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת גנים על התפתחות עוברים ויצירת רקמות אקטופיות.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis

גלה סרטונים נוספים