וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

פרוטוקול זה מדגים שיטת ביואינפורמטיקה של וידאו למדידת צמיחת מושבת תאי גזע עובריים אנושיים על ידי ניתוח סרטוני זמן-lapse שנאספו בחממת CT של תחנת ביו אייקון, המצוידת במצלמה להדמיית וידאו. מושבות תאי גזע עובריים אנושיים או מושבות HESC עוברות תרבית ל-70% קו-שטף, מצופות מחדש ומודגרות במשך 48 שעות, ולאחר מכן מושבות HESC מצולמות במשך 48 שעות נוספות ב-Biot ct. קצב הצמיחה נקבע באמצעות מתכוני שיפור פילוח ומדידה שפותחו עם תוכנת CL quant.

המתכונים מאומתים על ידי השוואה ל-Adobe Photoshop, כלי ניתוח תמונות המאפשר התאמה ידנית מדויקת של המסכה לכל מושבה. ניתן להשתמש בתחום המתפתח של ביואינפורמטיקה של וידאו כדי להפוך את העיבוד, הניתוח והכרייה של נתונים ביולוגיים מסרטונים מיקרוסקופיים לאוטומטיים. היי, אני סרינה לין מהמעבדה של ד"ר פרו טלבוט במחלקה לביולוגיה של התא ומדעי המוח כאן באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד.

היי, אני שון פינו, גם הוא ממעבדת טלבוט. היי, אני TI Satish מהתוכנית לביולוגיה מולקולרית והתפתחותית של התא. היום נראה לכם כיצד למדוד צמיחה של מושבת תאי גזע עובריים אנושיים באמצעות כלי ביואינפורמטיקה של וידאו.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי למדוד את ההשפעות של רעלים סביבתיים על התנהגות תאי גזע עובריים אנושיים. אנו נדגים הליך זה במתקן הליבה החדש של תאי הגזע שלנו. אז בואו נתחיל.

כדי להכין HESC לניתוח וידאו, גדל HESC על מטריג'ל מצופה שש צלחות באר עד 70% שאיבה מתכנסת מבאר אחת המכילה HESC ושטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של אקוטן ודגרו למשך דקה אחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הוסיפו 10 עד 12 חרוזי זכוכית לבאר ונערו את הצלחת בעדינות עד שהמושבות מתנתקות לחלוטין.

לנטרל אקוטן באמצעות מיליליטר אחד של תחזוקת תאי גזע עובריים אנושיים, מדיום או מדיום מותנה של פיברובלסטים עובריים של עכבר. אוספים תאים מנותקים ללא החרוזים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב -200 גרם למשך שלוש דקות. שפכו את ה-SUP natant ושברו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תאי גזע עובריים אנושיים טריים או צלחת M-T-E-S-R 100 מיקרוליטר של תרחיף HESC טיפה לתוך בארות מרובות של צלחת מצופה מטריג'ל 12 בארות.

נדנד את הצלחת קדימה ואחורה בעדינות והתבונן בתרביות תחת מיקרוסקופ אור כדי לגרום לגושי תאים מפוזרים באופן שווה ברחבי הבארות. הנח את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות כדי להבטיח שהתאים מחוברים שטוחים וגדולים מספיק כדי לדמיין בקלות. לאחר 48 שעות, שאפו את המדיום ושטפו בארות עם 500 מיקרוליטר PBS כדי להסיר תאים לא מחוברים, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום M-T-E-S-R לכל אחד.

ובכן, הנח מיד את הצלחת לתוך ה-Biot CT והתחל לאסוף תמונות זמן-lapse. נסה לבחור שדות עם מושבות בודדות דיסקרטיות שלא צפויות לצמוח למושבות אחרות. בפרוטוקול זה, התאים מוקלטים בווידאו במשך 48 שעות נוספות עם פריימים במרווחים של שבע דקות.

כדי ליצור תחילה את מתכון הפילוח, סרוק ידנית את הסרטון כולו כדי לוודא שהוא מכיל מושבה אחת שנשארת ממוקדת לאורך כל תקופת ההקלטה. לאחר מכן, פתח את אשף הפילוח בתוכנת CL quants ולחץ על הכפתור הבא. בחרו בערוץ התמונה הנכון ולחצו על הלחצן הבא.

בחר התאמה רכה ולחץ על הבא. בחר אזור דרוש אחד או שניים על ידי הקפת הקצה החיצוני לאזור המרכזי של המושבה. שטח זה צריך להיות קטן ככל האפשר, אך צריך לייצג את המושבה כולה.

אל תבחר יותר מדי אזורים מכיוון שהדבר עלול לגרום למריחת מסכה לא מדויקת. לחץ על הלחצן הבא. בחר לא רוצה אזורים על-ידי עיגול אזורים שאינם חלק מהמושבה ואינם חלק מהרקע.

לאזורים אלה יש דפוסים שיש לדכא, כגון פסולת ותאים מתים. לחץ על הבא. בחר רקע לפי אזורים מעגליים שאינם מושבות, פסולת או תאים מתים.

הרקע צריך להיות אחיד וסביר שיופיע בכל פריים. בדרך כלל, אנו בוחרים את הרקע האפור סביב המושבה. לחץ על הלחצן הבא.

יש להציג מסכה צבעונית מעל אזור העניין אם המסכה אינה מכסה במדויק את אזור העניין. טווח סף הפילוח בפינה הימנית התחתונה של המסך עשוי להיות מוגדל או קטן אם יש צורך בהחלפת מסכה. בחר עדכונים אזורי התאמה רכה.

זה מאפשר לשנות את אזורי הרצון לא רוצה או אזורי רקע. אם המסכה משביעת רצון, בחר החל סף ושמור את המסכה שלי. לאחר מכן לחץ על הכפתור הבא.

לאחר מכן המסכה תוצג בצבע אחר. בחר סיום. המתכון צריך להיות מוצג בפינה הימנית העליונה של התוכנה כמתכון לסגמנטציה.

שנה את שם המתכון אם תרצה על ידי לחיצה ימנית והזנת שם חדש. כדי ליישם את המתכון. לחץ לחיצה ימנית והנח את העכבר מעל.

החל מתכון. יופיע תפריט המאפשר בחירה של מספר המסגרות לשימוש. קבעו את מרווח המסגרות לכל 20 מסגרות כדי להבטיח נאמנות למסיכה.

בדקו באופן ידני באופן אקראי 10% מהמסגרות שעליהן הוחלה המסיכה כדי ליצור מתכון לשיפור שמבטל אזורים לא רצויים בפסולת. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תיקיית המתכונים לשיפור ולאחר מכן לחץ על חדש. מתכון שיפור חדש אמור להיות מוצג משדה הראייה המקורי.

הזז את העכבר מעל סמלים בסרגל הכלים כדי לזהות את כפתור מודול השיפור הממוקם מימין לתמונה ולחץ עליו. בחר תפריט נפתח להוספת תוויות. בחר תווית עבור מחוברים בחר תווית עבור שניים מחוברים.

שורת פעילות חדשה אמורה להיות מוצגת. קח את המסכה הראשונית ממתכון הפילוח וגרור אותה לתיבת הקלט. הסרגל אמור להציג כעת את מספר מסיכת הקלט.

גררו את הסמל עם מספר מסיכת הקלט לסמל אפס המסיכה. חפש גודל מינימלי בשורת המשימות והתאם את המספר עד להצגת אזור העניין בלבד. הקפד ללחוץ על ביצוע עבור כל ניסיון מתאים.

לאחר שהתאמת הגודל המינימלית משביעת רצון, לחץ על מתכון השיפור הקודם בתחתית המסך, בחר שמור למתכון. התוכנה מבקשת כעת להחליף את המתכון שנבחר ולבחור כן נקודה. בדוק את מתכון השיפור באמצעות אותו הליך כמו זה של פילוח בדיקה נקודתית.

אם אתה מרוצה ממתכוני הפילוח והשיפור, המשך ליצור את תבנית המדידה. כדי להתחיל לבחור, צור תבנית מדידה בסרגל הכלים הימני. בחלון המדידה, בחר הזז את הסמן מעל דמות תא אוסף תמונות.

החזק את מקש הבקרה ובחר את התא תחת קטע המורפולוגיה, בטל את הסימון של פרמטר ברירת המחדל ובדוק את פרמטר האזור. לאחר מכן צא מחלון התבנית. בחר את הסמל.

צור מתכון מדידה. שנה את שם המתכון. מעבר לכרטיסיית תבנית ובחירה בפינה השמאלית העליונה, גרור ושחרר את תבנית המדידה שנוצרה קודם לכן בחלון המדידה.

לחץ על כן כדי להמשיך בחלון מתכון המדידה, בחר מיפויי ערוצים. לאחר מכן תא שלם בחר מיפויי מסיכה. לאחר מכן בחר באפשרות תא שלם למסכה משופרת, בחר את מתכון המדידה תחת הכרטיסייה מתכון.

בחלון הראשי, בחר בסמל שמור בחלון מתכון המדידה. לאחר מכן סגור את החלון לאחר מכן סגור ופתח מחדש את שדה הראייה. לחץ לחיצה ימנית על תיקיית רשימת המתכונים ולאחר מכן לחץ על מתכוני גרירה חדשים לפי סדר היישום הדרוש לרשימת המתכונים, בחר נעל רשימת מתכונים והפעל את המתכונים ברצף על נתוני הווידאו באמצעות Adobe Photoshop.

כל מסגרת 20 של אותן מושבות נותחה. פתח ידנית מסגרת של תמונת מושבה ב-Adobe Photoshop. לחץ על כלי שרביט הקסמים בסרגל הכלים.

לחץ על האזור סביב המושבה כך שכל השדה מכוסה למעט אזור המושבה. ודא שהקו המקווקו סביב המושבה מתאים ממש סביב פריפריה של המושבה ולא בתוכה. אם הקו המקווקו אינו נמצא סביב הפריפריה, שנה את ערך הרגישות בסרגל הכלים העליון בהתאם.

לחץ על עריכה במצב מסיכה מהירה בסרגל הכלים ולחץ על המושבה כך שהמושבה תיבחר. עבור לחלון, משוך את התפריט ולחץ על היסטוגרמה. יש להגדיר את המטמון לאחד.

אם המטמון מורכב משניים, לחץ על סימן הקריאה של הביטוי כדי לשנות את המטמון לאחד. רשום את ערך הפיקסלים בגיליון אלקטרוני. חזור על התהליך לעיל עבור כל מסגרת 20.

לאחר מכן ניתן לשרטט נתונים שנאספו באמצעות תוכנות Photoshop ו-CL quant. הפרוטוקול שלנו לכימות צמיחת מושבת HESC מדגים יישום אחד של ביואינפורמטיקה בווידאו לבעיה ביולוגית. כאן אנו מציגים גרף המשווה את הגידול בגודל המושבה במשך 48 שעות כפי שנקבע באמצעות תוכנת CL quant ו-adobe Photoshop.

הגרף מציג חמש מושבות שונות שכל אחת מהן נותחה על ידי שתי חבילות התוכנה. כל מושבה מיוצגת על ידי צבע שונה. הקווים המוצקים נגזרו באמצעות תוכנת קוונטי מפרש ואילו הקווים המקווקוים נאספו באמצעות פוטושופ.

הגרף של הנתונים הגולמיים מראה ששתי שיטות המדידה תואמות היטב את העובדה שלמושבות יש גודל התחלתי שונה. איור זה מציג את הנתונים המשורטטים מחדש כאחוז הגידול בגודל המושבה. שיעורי הגידול דומים ללא קשר לגודל המושבה ההתחלתית ושני מדדי הניתוח נותנים תוצאות דומות.

הגרף הבא מציג את הממוצעים של נתוני השינוי באחוזים הקודמים על גידול מושבות HESC. גרף זה מראה בבירור התאמה טובה בין הניתוח שנעשה באמצעות ביואינפורמטיקה של וידאו לבין Adobe Photoshop. זה עתה הראינו לכם כיצד למדוד צמיחה של מושבת תאי גזע עובריים אנושיים באמצעות כלי ביואינפורמטיקה של וידאו.

בעת ביצוע הליך זה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, הקפד לכלול את ההילה סביב המושבה לבחירת מושבה מדויקת על ידי התוכנה. חשוב גם לזכור שניתן להשתמש בשיטות אחרות לתרבית, דגירה ואיסוף וידאו במקום הפרוטוקול שהדגמנו. לאחר פיתוח ותיקוף המתכונים, הם יבצעו ניתוח הרבה יותר מהר ועם פחות וריאציות ניסיוניות מאשר ניתוח ידני.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.