איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

חשישה ביולוגית באמצעות מודולציה מגנטית, או MMB, היא טכניקה חדשנית לגילוי מולקולות ביולוגיות. כאן מוצג ניסוי להוכחת היתכנות שבו מזוהה אינטרלוקין 8 כאשר אינטרלוקין 8, הנקרא גם IL 8, מתווסף לתערובת תגובה המכילה חרו지를 מגנטיים מצופים בנוגדן anti-IL 8 ביוטינילי וסטרפטאווידין מסומן פלואורסצנטית. כך נוצר "סנדוויץ' מולקולרי" המקשר ביעילות בין המולקולה הפלואורסצנטית לבין החרוד המגנטי.

התגובה ממוקמת בתוך מבחנה ובשדה מגנטי משתנה. גרדיאנטים מופעלים באמצעות שני קטבים אלקטרומגנטיים, המניעים את החרוזיים בתנועה תנודתית. התנועה המחזורית של החרוז, לו צמודים חלבונים פלואורסצנטיים, אל תוך קרן לייזר ניצבת ומחוצה לה, מייצרת אות פלואורסצנציה שנאסף על ידי PMT ועובר דמו-מודולציה.

באמצעות מגבר נעילה (lock-in amplifier), ניתן להמחיש את תנועת החרוצים באמצעות מצלמת CCD במקום ה-PMT; תנועה סינכרונית נצפית בדגימות שבהן החרוצים המגנטיים קושרו לחלבונים פלואורסצנטיים באמצעות IL8. שלום, אני עדיה מהמעבדה לאופטיקה לא ליניארית וללייזר במחלקה לאלקטרוניקה פיזיקלית באוניברסיטת תל אביב. אני נוגו מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו, ואני מרסלו ארליך מהמחלקה למחקר תאים ואימונולוגיה באוניברסיטת תל אביב.

היום נדגים בפניכם שיטה לזיהוי הומוגני מהיר של בדיקות ביולוגיות באמצעות מערכת חיישנים ביולוגיים המבוססת על מודולציה מגנטית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לזהות חלבונים ספציפיים ורצפי DNA בריכוזים נמוכים. לכן, בואו נתחיל.

התחל את הפרוצדורה על ידי הכנה וסימון של מבחנה עבור כל תגובה, כולל דגימת מטרה ודגימת ביקורת שאינה מטרה. לכל מבחנה, הוסף את הרכיבים הבאים של בדיקת ה-bio plex Precision Pro cytokine, אחד אחד: coupled magnetic beads, detection IL eight antibody, streptavidin PE ו-IL eight.Target. השלם את הנפח ל-100 microliters באמצעות assay buffer, ולאחר מכן נער במשך 30 דקות במנער אורביטלי קומפקטי.

לאחר ניעור הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, העבר אותן ישירות לקובטות לצורך אנליזה. נקה את הקובטות השקופות של מערכת ה-MMB באמצעות נייר ניקוי לעדשות ו-70% ethanol. המכשיר המשמש לאנליזה מורכב מלייזר עם הכפלת תדר של 488 nanometer המשמש כמקור אור עירור, המופנה באמצעות מחלק קרן דיכרואי של 562 nanometer אל עדשת מיקרוסקופ.

עדשת העדשה של המיקרוסקופ ממקדת את הלייזר לאלומה ברוחב 27 µm בתוך צינור זכוכית BO silicate ברוחב 400 µm. האור הנפלט מסונן ספקטרלית באמצעות שני מסנני פס (band pass filters) עוקבים, נמדד על ידי כופל פוטונים (PMT) ומודם מחדש באמצעות מגבר נעילה (lock-in amplifier). מודולטור זרם תוצרת בית משמש להעברת גל ריבועי באופן עוקב לכל אלקטרומגנט.

האמפליטודה צריכה להיות 1.4 amps עם תדר של one to six hertz כיוון שהחרוזים נכנסים לקרן הלייזר ויוצאים ממנה פעמיים בכל מחזור. תדר הדמודולציה במגבר ה-lockin הוא two to 12 hertz. הפעילו את המערכת על ידי סיבוב מפתח הלייזר של 488 nanometer למצב on והדלקת אספקת המתח.

לאחר מכן, הגדירו את הספק הלייזר למינימום, בערך ארבעה עד שישה milliwatts. הדליקו את האוסצילוסקופ, ולאחר מכן הדליקו את ה-PMT. בשלב הבא, מקמו את דגימת ה-vete בין שני הקטבים האלקטרומגנטיים.

השתמשו בבמה הסיבובית של ה-vete כדי להבטיח שקרן הלייזר עוברת דרך ה-vete ואינה פוגעת בדפנות שלו. השתמשו בבמה לתרגום XY, Z של ה-vete כדי לשנות את מיקומו ביחס לעדשת העדשה ולפולסים האלקטרומגנטיים. כדי למקסם את הצימוד של האור הפלואורסצנטי אל הגלאי, יש למקם את ה-vete מעט מאחורי קו הפולסים.

כעת הגדירו את האוסצילוסקופ למדידת עקבה בזמן. הגדירו את בקרת ההגבר של ה-PMT ל-0.5 bolts. לאחר מכן הפעילו את המודולטור של הזרם, והגדירו את התדר לשלושה hertz.

המתינו 30 שניות כדי לאפשר אגרגציה ועיבוי של החרו지를. החרוזים המגנטיים יתחילו להתנודד ויקרבו לקדמת המבחנה. כאשר קרן הלייזר פוגעת בחרוזים המתנודדים, אמור להיראות מהחרוזים הבהב של אור לייזר מוחזר.

שימו לב כי החרוצים נעים מהר יותר ככל שמודולציית הזרם עולה, ולאט יותר ככל שהיא יורדת. ניתן לכוונן את מיקום החרוצים בתוך המבחנה באמצעות במות הנשלטות על ידי מיקרומטר. כדי להזיז את הקטבים, ניתן להמחיש את תנועת החרוצים באמצעות מצלמת CCD המוצבת במקום ה-PMT.

האוסצילוסקופ מזהה את האות המחזורי מהחרוצים הפלואורסצנטיים המשוייכים ומתעד את עקבת הזמן של האוסצילוסקופ. ניתן לנתח את הנתונים השמורים באמצעות MATLAB. תערובות תגובה עם ובלי IL eight נבדקו באמצעות MMB. בכל התגובות עם המטרה, החרוצים יצרו אגרגט דחוס בודד שנע פנימה והחוצה מקרן הלייזר באופן מסונכרן.

עם זאת, ללא מטרה, החרו지를 היו פחות מאוגדים ותנועתם הייתה פחות מאוחדת. כאן, שעון אפולציית הקטבים המוצג בצהוב ואות המוצא של ה-PMT המוצג במגנטה מתארים את תדר האפולציה עבור כל קוטב בשני hertz. לפיכך, תדר הדמודולציה הוא ארבעה hertz, כפי שצפוי תיאורטית.

כאשר החרוזים עוברים בקרן הלייזר, ה-PMT מזהה את האור הפלואורסצנטי ונוצר שיא במתח המוצא של ה-PMT כאשר אות ה-PMT ושעון המודולציה הכפולה מוזנים למגבר הנעילה (lock-in amplifier). גלאי הפאזה הרגיש מבצע סנכרון ומניב תוצאות במתח גבוה. שני הצבעים מצביעים על שתי סריקות שונות באותה ריכוז מטרה.

הקווים השחורים מייצגים את הממוצע של כל אות. המגבר בעל הנעילה (lock-in amplifier) לא זיהה אות כלשהו כאשר נבדקה דגימת הביקורת. במקרה זה, המגבר בעל הנעילה לא סיפק אות נעול.

עובדה זו, יחד עם ההבדל החזותי באגרגציה, מצביעה על כך שמערכת ה-MMB וההבדל במדידות עקומת הזמן של אות הפלט של ה-PMT יכולים לזהות בבירור את נוכחותו של מטרה מסוג ILH. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לזהות מולקולות ביולוגיות באופן מהיר והומוגני באמצעות מודולציה מגנטית, כאשר ה-IL eight משמש כדוגמה לבדיקת חיישנים ביולוגיים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול בהתאם לנהלי הבטיחות בעבודה עם לייזר. זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.