Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי
22 בדצמבר 2010
Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.
המטרה הכוללת של נוהל זה היא לקבוע את תפקוד החלבון של הגן על ידי שיבוש דפוסי הביטוי הנורמליים של הגן או החלבון הנבדקים. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת תבנית ה-aros ומחטי ההזרקה. השלב השני של הנוהל הוא איסוףו של עוברים בבשלב התא הבודד.
השלב השלישי של הפרוטוקול הוא הצבת עוברים בשלב תא אחד במיקום הנכון להזרקה. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא הזרקת סמני תאים (cell tracers), mRNA או אוליגנוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotides) לתוך עוברים של midar בשלב תא אחד. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות באמצעות תצפית מיקרוסקופית המראה שינויים מורפולוגיים, פיזיולוגיים או מולקולריים הקשורים לחלבון שמושפע מהחומר המוזרק.
שלום, אני שון בראזינסקי מהמעבדה של ד"ר מקוטו סקי במחלקה לביולוגיה וביוכימיה באוניברסיטת באת'. אני חלק ממעבדתו של ד"ר סקי. היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה מיקרוסקופית של סומני תאים, mRNAs ואוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס לעוברי zebrafish.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקוד של גן עניין in vivo ברמת התא הבודד. אם כן, בואו נתחיל. בניגוד לדגי Zebrafish, ניתן להבחין בקלות בין זכרים לנקבות של Maka באמצעות סנפריהם הדימורפיים.
לסנפירים של הנקבה יש צורה עגולה עם שוליים חלקים. הן הסנפיר האנלי והן הסנפיר הגבי של הזכר גדולים יותר מאלו של הנקבה, ובסנפיר הגבי ישנו שקע עמוק בין שתי הקרניים האחרונות. יש להחזיק זוג המתרבב של meca במיכל רבייה עם או ללא זרימת מים.
ניתן להחזיק את ה-P במיכל עם מים זורמים למשך עד חודשיים. להזרקה יומית, המקה עשויה להטיל עד 40 ביצים מדי יום, אשר נצמדות לבטן באמצעות סיבי היצמדות. השתמש ברשת כדי לתפוס ולהוציא נקבה מהמיכל והחזק את הדג ביד אחת כדי לקבע אותו בתוך הרשת. הפרד בעדינות את הביצים באמצעות האצבע המורה.
החזירו את הנקבה לאקווריום. השתמשו בפינצטה או באצבע המורה כדי להעביר את הביצים לצלחת פטרי בקוטר ששה סנטימטרים הממולאת בתווך להביאים (embryo medium). תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי לחתוך את סיבי ההיצמדות ולהפריד את הביצים מהצברים.
העבירו עוברים באמצעות פיפטת פסטה כדי להפרידם מצואה ואצות, והעבירו מקסימום 40 ביצים לצלוחית עם Medium טרי לעוברים. הניחו את הביצים על קרח אם ההזרקה המיקרוסקופית תבוצע באופן מיידי. לחלופין, ניתן להשפיע על מהירות ההתפתחות לשלבים מאוחרים יותר באמצעות שינויים בטמפרטורת הדגירה.
נדרשת תבנית פלקסיגלס להכנת פלטות אגרוז להחזקת עוברים במהלך ההזרקה. לפרטים נוספים, עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. שפכו 0.5 סנטימטרים של 1.5% אגרוז במים לתוך צלחת פטרי של תשעה סנטימטרים.
כאשר ה-aase התמצק, גזרו שטח הקטן מעט מהתבנית כדי שהתבנית לא תשקע לתחתית. בנו את השטח הגזור עם עוד 1.5% aase והניחו מעליו את תבנית הפלקסיגלס. הימנעו מהחדרת בועות אוויר כאשר ה-Aris התמצק.
באופן כללי, שחררו את התבנית כדי ליצור תעלות. כסו את ה-Aris במצע לעוברים. כסו את הצלחת ושמרו בטמפרטורה של four degrees Celsius עד למועד השימוש.
הכינו מחט הזרקה רחבה וחזקה מתוך קפילרה של זכוכית המכילה פילמנט. השתמשו במיקרו-לודר (micro loader) כדי למלא את מחט ההזרקה בתמיסת הזרקה, הכוללת phenol red כסמן, וחברו את המחט למעמד הזרקה עם משאבת אוויר. הציבו את המערכת לצד מיקרוסקופ דיסקציה.
העבירו ביצים בשלב ההתפתחות המתאים לצלחת ההזרקה. ניתן לשמור את העוברים על קרח למשך עד 30 דקות כדי לעצור את ההתפתחות בעוד ביצוע ההזרקה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה כדי לסדר שבע עד 10 ביצים בכל תעלה.
סובב את הביצים כך שמחט ההזרקה יפגע בביצים באופן מאונך. התא הבודד של העובר נמצא מול טיפות השמן. לכן, יש לכוון את טיפת השמן שמאלה, כך שהתא הבודד יהיה מימין לצורך ההזרקה.
חומצות גרעיניות וצבעי סימון מוזרקים במיקרו-הזרקה דרך ה-Corion אל תוך הציטופלזמה של העובר ולא אל תוך החלמון. עבור דגי זברה, קרב את המחט אל הביצים. גע עם קצה המחט ב-Corion או השתמש בפינצטה מיקרוסקופית כדי לפתוח את קצה המחט, כך שכמות קטנה של תמיסת ההזרקה תזרום החוצה מהקצה.
שברו מחדש את המחט במקרה של חסימה, נקבו את ה-Corian והזיזו את קצה מחט ההזרקה פנימה אל השכבה הפנימית כדי להפחית את הסבירות לרפלקס לתוך המחט. כוון את לחץ ההחזקה של המזרק לערך של 80 עד 100 hectopascals באופן חד. נקבו את הממברנה והחדירו את המחט אל הציטופלזמה.
הזריקו את העובר. התבוננו בעובר מהצד כדי לוודא שהחומר המוזרק התפזר באופן שווה בתוך הציטופלזמה. לנוזלים שהוזרקו כהלכה לתוך הציטופלזמה יש גבול מטושטש; חומר שהוזרק עמוק מדי לתוך החלמון יציג גבול ברור ולא יעבור לציטופלזמה.
העבירו את העוברים המוזרקים לכלי נקי המכיל מדיום לעוברים ואפשרו להם להתפתח לפי הצורך בתוך אינקובטור בטמפרטורה מתאימה. פאנל A מציג תמונה מייצגת של הזרקה נכונה של rumine dextran לתוך הציטופלזמה של עובר Meca בשלב תא אחד. פאנל B מציג תמונה מייצגת של הזרקה שגויה של rumine dextran לתוך שק החלמון של עובר Meca בשלב תא אחד. קווים מקווקווים מציינים את קווי המתאר של הציטופלזמה של תא אחד.
פאנלים C ו-D מראים את העובריים מהפאנלים A ו-B בהתאמה, כ-30 שעות לאחר ההזרקה. שימו לב שגוף העובר בפאנל D אינו אדום, כיוון שהצבע הוזרק בטעות לשקיק החלמון. הרגע הדגמנו כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של חומצות גרעין או חומרי מעקב לשלב התא הבודד בעובריים כהים יותר.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בעוברים שנמצאים בשלב התפתחותי נכון כדי להבטיח הזרקה מוצלחת. זהו כל התהליך. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את טכניקת המיקרו-הזרקה לעוברים של דגי מדקה (medaka), החיונית לניתוח גנטי במודלים של חוליתיים. הוא מפרט את השלבים הדרושים להזרקה מוצלחת, כולל הכנת העוברים ושיטות ההזרקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אמבריולוגיה
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- דג המדקה ודג הזברה משמשים כמודלים משלימים למחקרים גנטיים.
- מיקרו-הזרקה היא טכניקה קריטית למניפולציה של ביטוי גנים.
- הבנת תפקוד הגנים חיונית למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- שלב עוברי (staging) נכון הוא קריטי להצלחת המיקרו-הזרקה.
מטרת המחקר
- קביעת תפקוד חלבון גן על ידי שיבוש דפוסי ביטוי נורמליים.
- הדגמת תהליך המיקרו-הזרקה בעוברי דג המדקה (medaka).
- סיוע במחקרי in vivo של תפקוד גנים ברמת התא הבודד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תבניות אגרוז להחזקת עוברים.
- איסוף והכוון של עוברים בשלב תא אחד.
- מיקרו-הזרקה של חומצות גרעין וסמני מעקב (tracers) אל הציטופלזמה.
- תצפית על שינויים מורפולוגיים ופיזיולוגיים לאחר ההזרקה.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מוצלחת מובילה לשינויים ניתנים לצפייה בהתפתחות העובר.
- הזרקה נכונה אל תוך הציטופלזמה היא קריטית למניפולציה גנטית יעילה.
- אישור חזותי להצלחת ההזרקה מושג באמצעות מיקרוסקופיה.
- הזרקה שגויה אל תוך שק החלמון גורמת לגבולות ברורים ולהיעדר שינויים בביטוי הגנים.
מסקנות
- מיקרו-הזרקה היא שיטה יעילה לחקר תפקוד גנים בעוברים של דגי מדיקה (medaka).
- טכניקה נכונה וטיפול ראוי בעוברים חיוניים להצלחת הניסויים.
- פרוטוקול זה מספק בסיס למחקרים גנטיים נוספים בחולייתנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
מיקרו-הזרקה של עוברי medaka מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת לצורך תיקוף מטרות במודלים של חולייתנים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. הטכניקה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך סריקה פנוטיפית ופיתוח בדיקות, תוך ניצול המשלימיות הגנטית של medaka עם דגי זברה (zebrafish) לזיהוי מטרות חדשות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי כך שהיא מאפשרת בחינה פונקציונלית של גנים רלוונטיים in vivo.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות השתקה ממוקדת של גנים או ביטוי יתר כדי להבהיר את תפקוד הגן.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בתוצאות הפנוטיפיות של הפרעה גנטית.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות יצירת נתונים כמותיים על שינויים מולקולריים ומורפולוגיים הקשורים לתפקוד חלבונים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוּקפות לסריקות המשך על ידי הבטחת שלבי התפתחות עובריים עקביים ודיוק בהזרקה.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה הניתנים לשחזור ואישור חזותי של מסירת התוכן לציטופלזמה.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מספר יעדים באמצעות הליכים סטנדרטיים להכנת מחטים וליישור עובריים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאי גילוי לבאלידציה פרה-קלינית באמצעות מסלולים שמרניים של חולייתנים הניתנים לצפייה באמבריוגנזה של medaka.
- הסרת סיכונים מכניסטית: מפחיתה עמימות בתיקוף המטרה על ידי הבחנה בין תוצאות של הזרקה ציטופלזמית לתוצאות של הזרקה לסגסוגת באמצעות מיקרוסקופיה.
- מערכת רלוונטית למחלה: מנצלת את השונות הגנטית של medaka לעומת zebrafish כדי לחשוף פנוטיפים שהוחמצו במחקרים של מין בודד, ובכך מרחיבה את היקף המטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות להערכת תפקוד גנים לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), כאשר התוצאים מכוונים להחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) בהתבסס על חומרת הפנוטיפ וספציפיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות התרה מדויקת במרחב ובזמן של ביטוי גנים בעוברים מתפתחים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של עוברים וכיול מחטי הזרקה להחדרה עקבית של תרכובות או חומצות גרעיניות.
- אנליטיקה: מספקת מדדי פנוטיפ כמותיים באמצעות מיקרוסקופיה, המאפשרים השוואה בין עוברים מוזרקים לעוברים של קבוצת הביקורת לצורך תיקוף המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודות פרה-קליניות דרך מסלולי התפתחות שמורים, ובכך תומכת בהשלכת הממצאים למודלים של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר עבור קמפיינים של סריקה גנטית באמצעות הליך סטנדרטי להכנת תבנית אגרוז וטיפול בעוברים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות באמצעות תצפית פנוטיפית ישירה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות ייחוס סטנדרטי של העוברים, הגדרות לחץ הזרקה (80-100 hPa), ואישור מסירה ציטופלזמית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של מטרות לפני השקעה באופטימיזציה יקרה של מובילים (lead optimization).
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי יצירת פנוטיפים מורפולוגיים ומולקולריים ברורים הקשורים לתפקוד הגן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במבריולוגיה ובמיקרו-כירורגיה לצורך שלב העוברים נכון וטיפול נאות במחטים.
- תלוי בציוד הכולל מיקרו-מזרקים, מיקרוסקופי ניתוח ומחטי קפילריה להגשה מדויקת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להרכב תווך העוברים, טמפרטורת הדגירה ותזמון ההזרקה לצורך השגת תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני דגים שונים, עקב הבדלים במבנה הכוריון ובגודל החלמון המשפיעים על עומק ההזרקה.
- מוגבל על ידי זמינות העוברים וסנכרון התפתחותי, מה שדורש התאמה מתוזמנת ושלוב תחת בקרת טמפרטורה עבור מחקרים רחבי היקף.
