גרורה ניסויית Assay
24 באוגוסט 2010
מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את היכולות הגרורתית של תאים סרטניים אנושיים על ידי הזרקות לווריד הזנב. בעכברים חסרי חיסון, התאים מוכנים להזרקה. לאחר מכן מוזרקים התאים לעכברים חסרי חיסון, אשר ייצרו גרורות ריאה לאחר חודש עד חודשיים.
העכברים מנותחים וגרורות ריאות מכומתות ומתורבתות. תוצאות של בדיקה מסוג זה מצביעות על היקף הגרורות של סוג מסוים של תא סרטני. היי, אני סונאלי מוהנטי מהמעבדה של ד"ר LE במחלקה לגנטיקה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר.
היום נראה לך נוהל לביצוע בדיקת גרורות ניסיונית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור גרורות סרטניות. אז בואו נתחיל.
התחל עם תאים שגדלו לכ-70% Co fluency, שאב מדיה מהצלחת ושטוף בעדינות פעם אחת עם XPBS אחד. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 0.05% היפוך טריפסין. נדנד בעדינות את הצלחת כדי להקל על ניתוק התאים.
התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כשהם מתנתקים. הוסף נפח גדול של מדיה המכילה FBS כדי להרוות את הנסיעות בפעילות. לאחר מכן מעבירים לצינור של 50 מיליליטר.
ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו. לאחר קביעת הריכוז, צנטריפוגה בערך פי 200 מכוח הכבידה למשך שלוש דקות מבלי להפריע לכדור התא. הסר בזהירות את ה-Media Resus המשהה נפח מתאים של תמיסת חיץ האיזון של האנק או HBSS כדי להגיע לריכוז סופי של בערך פי חמישה פי 10 לששת התאים למיליליטר.
לאחר מכן, סננו דרך מסננת התאים של פלקון בקוטר 70 מיקרומטר. כדי לא לכלול אגרגטים של תאים גדולים, הנח את קצה הפיפטה ישירות על המסנן, המונח מעל צינור תרבית של חמישה מיליליטר. הוצא במהירות את המתלה דרך המסנן לתוך הצינור.
ספור את התאים שוב באמצעות טריאן כחול כדי לקבוע את הכדאיות. הכדאיות צריכה להיות גדולה מ-90% לפני ההזרקה. לאחר מכן יש לדלל לריכוז סופי של 2.5 כפול 10 לששת התאים למיליליטר.
המשיכו על הקרח. תפוס בעדינות את זנבו של עכבר חסר חיסון ומשוך אותו לתוך ריסון העכבר כשגבו אל החריץ וזנבו בולט החוצה מהפתח הקטן מאחור. החלק לאט את הטבעת פנימה לאורך החריץ.
ברגע שהטבעת תופסת את פיו של העכבר, נעל אותו במקומו. העכבר לא אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אך צריך להיות בעל קצב נשימה תקין. מצא את ורידי הזנב העיקריים.
ארבעה כלי דם עיקריים נמצאים בזנב עכבר. העורקים ממוקמים בצד הגב והגחון של הזנב. הוורידים ממוקמים בצדדים הרוחביים.
שואבים לפחות 200 מיקרוליטר מהתאים המוכנים למזרק של מיליליטר אחד. חבר חצי מחט בגודל 30 ודחף החוצה את כל בועות האוויר. הנפח הסופי במזרק צריך להיות 200 מיקרוליטר.
התכוננו להזרקה לקצה הדיסטלי של הזנב. כך שאם הניסוי הראשון נכשל, ניתן להשתמש באזור קרוב יותר של הזנב לניסיון שני. לאחר ניגוב מקום ההזרקה עם 70% אתנול, משוך את הזנב ישר.
החזק את הקצה עם האגודל ותמוך בנקודת ההזרקה עם האצבע המורה. הכנס את המחט לווריד והזריק את התאים. ודא שהמחט והמזרק מקבילים לווריד במהלך ההזרקה.
אחרת, המחט תחדור דרך דופן הכלי ותאים יוזרקו לרקמות הזנב הסמוכות. משוך את המחט אם ההליך עבר בהצלחה. הדם אמור לחלחל ממקום ההזרקה.
לחצו על צמר גפן נקי כדי להקל על השימוש בחוט דנטלי ומישוש את הזנב כלפי מעלה כדי לדחוף כל דגימה שנותרה למחזור הדם. שחרר את העכבר מהמסנן והחזיר אותו לכלוב. רשום את מספר ניסויי ההזרקה ואת מספר התאים שהוזרקו במחברת מעבדה.
קבע את כדאיות התאים לאחר ההזרקה. כמו קודם, שלב זה מספק ביטחון שהתאים נשארים בחיים לאורך כל תהליך ההזרקה. בסוף ניסוי ההזרקה, כדאיות התאים תפחת, אך צריכה להישאר מעל 80%כשלב אופציונלי, סובב את התאים הנותרים ושטוף את הכדורים עם PBS פעם אחת.
לאחר מכן הקפיאו את הכדורים במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים כגון כתמים מערביים. כדי לאשר את ביטוי הגנים בנוקדאונים לאחר חודש עד חודשיים, נתחו את העכברים כדי לקבוע את מיקומי הגרורות. התחל בהנחת העכבר המורדם על תחנת דיסקציה.
מרססים את העכבר בנדיבות באתנול. חותכים את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות והלב. לאחר מכן כרתו אותם בזהירות והניחו אותם ב-PBS.
הריאה היא האתר העיקרי לגרורות מכיוון שהיא מכילה את מצע הנימים הראשון שהתאים נתקלים בו. לאחר שהם נכנסים למחזור הדם, הסר את הלב ושטוף את הריאות ב-PBS ואז התבונן בכל אונה של הריאה תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר הגרורות הניתנות לזיהוי משני צידי הריאה, ולאחר מכן את מספר גרורות הריאות בכל ארבע האונות יחד כדי לקבוע את המספר הכולל של גרורות ריאה.
לאחר מכן, בודד גרורות ריאה בודדות על ידי כריתה באמצעות מספריים. העבירו כל גרורה למסננת תאים של 70 מיקרומטר וטחנו אותה באמצעות קצה מכסה מחט סטרילי. שוטפים את מסננת התאים בכמה מיליליטר מדיום ואוספים את התאים העוברים דרך המסנן.
בצלחת תרבית, כל מנה מכילה את התאים מגרורות אחת. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים לפחות ללא הפרעה. בתחילה, גם תאי סרטן וגם תאי פיברובלסטים יגדלו על הצלחות, אך בהדרגה תאי הפיברובלסטים ימותו ויוחלפו בתאים סרטניים.
אם תאי הסרטן נושאים גנים עמידים לתרופות, בחר את התאים עם אנטיביוטיקה מתאימה לאחר שלושה ימים, שטפו את כל שאריות הדם או הרקמות, הפסולת על הצלחת עם PBS והוסיפו מדיום טרי. העריכו את טוהר התאים הנגזרים על ידי צביעה חיסונית בנוגדנים כנגד חלבונים ספציפיים לבני אדם כאן ונעשה שימוש בנוגדנים אנטי-אנושיים גם בהיעדר בחירת תרופות. יותר מ-99% מהתאים צריכים להיות אנושיים.
כעת ניתן להזריק את התאים החדשים שהופקו שוב לעכברים חסרי חיסון כדי לבחון את יכולותיהם הגרורניות בתום בדיקה זו. קו תאי סרטן גרורתי מאוד מוליד בדרך כלל גרורות ריאות רבות, בעוד שמעט מאוד גרורות ריאה יגיעו מקו תאי סרטן גרורתי גרורתי. תמונות אלה מראות גרורות בריאות חודשיים לאחר הזרקת קו תאי המלנומה האנושית.
א 3 7 5 ס"מ. התאים המופקים בשיטה זו בדרך כלל גורמים ליותר גרורות מאשר קו ההורים כאשר הם נבדקים. שוב באמצעות בדיקה זו, זה עתה הראינו לך את ההליך לביצוע בדיקת גרורות ניסיונית.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב מאוד לזכור לוודא שהתאים מוזרקים לווריד הזנב, אך לא לרקמת הזנב שלו. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר מבחן גרורות ניסיוני המשמש להערכת הפוטנציאל הגרורות של קווי תאים סרטניים אנושיים באמצעות זריקות לוורידי הזנב בעכברים חסרי חסינות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אונקולוגיה
- מחקר גרורות
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- הבנת גרורות סרטניות היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- מבחנים ניסויים עוזרים בכימות הפוטנציאל הגרורות של תאים סרטניים.
- עכברים חסרי חסינות מספקים מודל מתאים לחקר התנהגות תאים סרטניים אנושיים.
- זריקות לוורידי הזנב הן שיטה נפוצה להערכת גרורות ריאות.
מטרת המחקר
- לבדוק את היכולות הגרורות של תאים סרטניים אנושיים.
- לכמת ולטפח גרורות ריאות שנוצרו מתאים מוזרקים.
- לספק תובנות לגבי הפוטנציאל הגרורות של קווי תאים סרטניים שונים.
שיטות ששימשו
- הכנת תאים סרטניים אנושיים להזרקה.
- הזרקת תאים לווריד הזנב של עכברים חסרי חסינות.
- מעקב אחר התפתחות גרורות ריאות לאורך חודש עד חודשיים.
- ניתוח פתוח של העכברים לכימות וטיפוח גרורות ריאות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של גרורות ריאות מתאים סרטניים מוזרקים.
- כימות הגרורות מספק נתונים על הפוטנציאל הגרורות.
- גרורות מטופחות ניתנות לשימוש לניתוח נוסף.
- התוצאות מצביעות על שונות ביכולות הגרורות בין קווי תאים סרטניים שונים.
מסקנות
- מבחן הגרורות הניסיוני יעיל להערכת התנהגות תאים סרטניים.
- התובנות שהושגו יכולות להדריך אסטרטגיות טיפוליות נגד סרטן גרורות.
- מחקרים נוספים יכולים לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור מנגנונים בסיסיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The experimental metastasis assay provides a quantitative in vivo model to assess the metastatic potential of human cancer cell lines, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling the isolation and propagation of highly metastatic derivatives, the assay facilitates the identification of genes and pathways regulating metastatic progression, thereby informing lead identification and preclinical prioritization. This approach enhances predictive confidence in downstream therapeutic development by linking in vitro findings to functional metastatic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying metastatic ability of cancer cells following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo readout for functional target validation in metastasis-relevant pathways.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular alterations to metastatic phenotypes in immunocompromised mice.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metastasis counts that serve as dependent variables for screening modulators of metastatic dissemination.
- Operational Value: Standardizes cell preparation, injection, and tissue harvesting procedures to ensure reproducibility across experiments.
- Scientific Value: Enables derivation of metastatic cell lines with enhanced invasive properties for use in secondary screening and target deconvolution.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system where lung metastasis formation mirrors clinical patterns of hematogenous spread.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing re-injection of cultured metastases to assess stability of the metastatic phenotype.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery by enabling molecular profiling of isolated metastases compared to parental lines.
Pipeline & Workflow Integration
The assay functions as a discovery-stage tool that bridges target hypothesis testing with phenotypic validation, informing decisions on compound progression and mechanistic follow-up in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of metastasis regulators through quantitative lung colonization assays.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (metastasis number per lung) enabling comparison across genetic or chemical conditions.
- Analytics: Generates count-based data suitable for statistical analysis to determine significant differences in metastatic potential.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by providing a model that reflects organ-specific metastatic tropism.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating metastatic capacity across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by demonstrating causal links between gene modulation and metastatic suppression or enhancement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell viability thresholds (>90% pre-injection, >80% post-injection) and standardized injection volumes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional metastasis data that complements in vitro invasion and proliferation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated effect on metastatic burden in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, intravenous injection techniques, and aseptic tissue dissection.
- Dependent on access to immunodeficient mouse models and facilities for long-term animal housing (one to two months).
- Necessitates standardized protocols for cell preparation, viability assessment, and metastasis quantification to minimize variability.
- Involves technical considerations for metastasis isolation, including enzymatic or mechanical dissociation and filtration to obtain single-cell cultures.
- Limited to modeling early dissemination and lung colonization; does not capture later stages of metastasis such as extravasation or distant organ growth beyond the lung.
