Name: גרורה ניסויית Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למדו שיטה להערכת פוטנציאל גרורה של תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקה לווריד הזנב בעכברים חסרי חיסון. שיטה זו מאפשרת כימות גרורות ריאה ותרבותן לניתוח נוסף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה נבדק אופטימיזציה תחילה במעבדה של ד&quot;ר ריצ&#39;רד היינס (MIT). המימון ניתן על ידי פרס NYSTEM IDEA (ל LX) ורות ל Kirschstein בפרס הלאומי לחקר שירות (כדי LX).

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ומחוברות ~ 70% בתקשורת הספציפיים שלהם עם גורמי גדילה או FBS (למשל, DMEM עם FBS 10% MC-1 תאים). לשאוב התקשורת מהצלחת בעדינות לשטוף מספר פעמים עם 1 x PBS (8 g / L של NaCl, 0.2 גר '/ L של KCl, 1.15 גר' / L של Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 0.2 גר '/ L של KH 2 PO 4, pH 7.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ומוסיפים 2 מ"ל של טריפסין 0.05% ב versene (0.014 g / L של פנול אדום 0.2 גרם / L של EDTA-Na ב 1 x PBS, pH 7.2). בעדינות רוק צלחת כדי להקל על ניתוק התא מהצלחת. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. בדרך כלל לוקח 2-5 דקות עבור התאים לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח נרחב של כלי התקשורת המכיל FBS (או מעכב טריפסין סויה) להרוות את פעילות טריפסין לאסוף תאים במבחנה בז 50 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. טען 10μL של השעיה על תא hemacytometer נקי. מספר תאים לכל מ"ל שווה לממוצע # של תאים כל אחד מחמשת ריבועים כפול 10 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד (או ~ 200 XG) בצנטריפוגה benchtop במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה. Resuspend תאים בנפח מתאים הפתרון הצפת הנקס מאוזן (HBSS) להגיע הריכוז הסופי של ~ 5 x 10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים סינון דרך מסננת 70 תא פלקון מיקרומטר להוציא אגרגטים תא גדול. הניחו את קצה פיפטה ישירות על גבי המסנן מעל צינור שכותרתו פלקון 5 מ"ל תרבות. מהר להוציא את ההשעיה דרך המסנן לתוך הצינור תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים שוב באמצעות hemacytometer ו לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מ"ל x 10 / 6. שמור את התאים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את יכולת הקיום של התאים. מערבבים כמה תאים עם trypan כחול למדוד את אחוז (כחול) תאים מתים על פני תאים הכולל שימוש hemacytometer. יכולת הקיום של תאים צריך להיות ≥ 90% לפני הזריקה. </li></ol> 2. הזרקה תוך ורידי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה כפפות. בעדינות לתפוס את הזנב של העכבר immunodeficient (עירום, NOD-SCID, או NSG, המעבדה של ג'קסון) ולמשוך אותו עוצר את העכבר, עם הגב שלה נגד החריץ ואת זנבו מבצבץ מתוך פתיחת קטן בחלק האחורי של עוצר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להחליק את הטבעת פנימה לאורך החריץ ולנעול אותו במקום טבעת פעם תופס את הפה של העכבר. העכבר לא אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אבל צריך הקצב הרגיל של נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הוורידים זנב גדול. ארבעה כלי הדם הגדולים נמצאים זנב עכבר. כלי דם בצידי הגב ועל הגחון של הזנב הם העורקים. ורידים הם בצידי לרוחב הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר יותר מ 200 μL של תאים מוכן לתוך מזרק 1mL. צרף את המחט 30 G1 / 2 אינץ לדחוף החוצה כל בועות אוויר העלולות להתקיים. נפח סופי של תאים המזרק צריך להיות 200 μL (כלומר, 5 X 10 5 תאים בסך הכל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריקים תאים לווריד הזנב. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחלה מהקצה הדיסטלי של הזנב, כך שאם הניסיון הראשון נכשל, אזור הפרוקסימלי יותר של הזנב יכול לשמש לנסות שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הזנב עם אתנול 70%. משוך את הזנב ישר. החזק את קצה הזנב עם האגודל תמיכה הנקודה להזרקה עם האצבע המורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט אל הווריד מזריקים תאים. ודא מחט מזרק מקבילים הווריד במהלך ההזרקה, אחרת יהיה לתקוע את המחט דרך דופן כלי ולהזריק את התאים לתוך הרקמות הסמוכות הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המחט לאחר ההזרקה. דם צריך פזרני מאתר ההזרקה אם הזריקה הלך בהצלחה. לחצו על פיסת נקי של מגבת נייר או צמר גפן על הזריקה כדי להקל על קרישת ו למשש את הזנב כלפי מעלה לדחוף את כל המדגם שיורית בווריד למחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העכבר מן עוצר ולהחזירו לכלוב. תעדו את תהליך ההזרקה (למשל, בכמה משפטים זה לקח להזריק את התאים כמה הוזרקו תאים) במחברת המעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את יכולת הקיום של תאים לאחר ההזרקה, כמתואר בסעיף של הכנת המדגם, שלב 9. צעד זה מספק ביטחון כי תאי להישאר בחיים לאורך כל תהליך ההזרקה. בסוף הניסוי זריקה, את הכדאיות של התאים תהיה ירידה, אבל צריך להיות מעל 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (לא חובה) ספין את שאריות התאים ולשטוף את כדורי עם PBS פעם. להקפיא את כדורי ב -80 מעלות עבור ניתוחים בעתיד (למשל, כתמים המערבי לאשר ביטוי גנים או knockdowns). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל אחרי חודש או חודשיים, העכברים יהיה גזור ואת המיקומים של גרורות נקבעים גסה. ריאות הוא האתר העיקרי גרורות, שכן הוא מכיל את המיטה נימי הראשון התאים את המפגש לאחרהזן את זרימת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה עם PBS, כל האונה של הריאה (או רקמות אחרות המכילות גרורות) הוא ציין תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1). מספר לגילוי גרורות בשני צידי הריאות נספר והמספרים של גרורות הריאה על כל ארבע האונות מתווספים יחד המספר הכולל של גרורות בריאות. 1 גרורות ריאות מזוהים בקלות רבה יותר אם הריאות המתוקנות לילה פורמלין מאז גרורות יהיה apppear כמו כתמי לבנבן בניגוד לרקמות סמוכות חום כהה ריאות. </li></ol> 3. Culturing תאים גרורות ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרורות הריאה מבודדים עכברים שהוזרק. כל אחד צריך להיות תרבותי בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרורות כל טחון עד סוף כובע מחט (סטרילית) על מסננת 70 תא מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מסננת תא עם ה-MLS כמה בינוניים תאים שנאספו שעוברים דרך המסנן בצלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות לפחות ארבעה ימים ללא הפרעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דם או רקמות פסולת על צלחת עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי. בהתחלה, הן תאים סרטניים ותאים פיברובלסטים לגדול על הצלחות, אבל בהדרגה, תאים פיברובלסטים ימותו החוצה להיות מוחלף על ידי תאים סרטניים. אם התאים הסרטניים לשאת גנים עמידים סמים, בחר את התאים באמצעות אנטיביוטיקה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוהר של תאים שמקורם נבחנת על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים נגד אדם ספציפי חלבונים. אנו משתמשים נוגדן אנטי אנושי vimentin (NCL-VIM-V9, Novocastra). התאים לנו נגזרת בדרך כלל מכילים מעל 99% של תאים אנושיים, אפילו בהיעדר בחירה סמים. התאים שמקורם החדש יכול להיות מוזרק שוב לעכברים immunodeficient לבחון את היכולות שלהם גרורתי, כפי שתואר לעיל. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף assay זה, תא גרורתי מאוד לקו בסרטן בדרך כלל מעורר גרורות הריאה רבים (איור 1), 1 בעוד גרורות הריאה מעט מאוד יבוא קו גרורתי גרוע תאים סרטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שמקורם בשיטה זו בדרך כלל להצמיח גרורות יותר לקו ההורים, כאשר הם נבדקים שוב באמצעות assay. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. נציג תמונות של הריאות העכבר לאחר וריד זריקות זנב של תאים סרטניים. 5 x 10 5 של קו מלנומה גרורתית האדם תאים, התאים SM, 4 היו מוזרק לווריד הזנב של עכברים immunodeficient. חודשיים לאחר מכן, הריאות היו מבודדים וגרורות נמצאו מפוזרים בין רקמת הריאה נורמלי.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. היא כוללת ארבעה צעדים מרכזיים: ניתוק של תאים סרטניים מ לוקוסים העיקרי שלהם, כניסתם למחזור (intravasation), יציאתם מן המחזור (extravasation), הישרדות וצמיחה באיבר מרוחק. גרורות האדם נחשב תהליך איטי לידי ביטוי לעתים קרובות, לאחר שנים של חביון. כדי ללמוד ההתקדמות שלה מבעוד מועד, assay לעיל ניסיוני מהיר יחסית הוקמה בשנת עכברים immunodeficient. 4 מאז הקמתה, נעשה בו שימוש יעיל לבודד תאים שונים עם יכולות גרורתי, לזהות גנים למעלה או ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 2.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>מבחנת פלקון 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים Falcon 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>מבחנת תרבית פלקון 5ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>מחט 30 &amp;frac12; gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר קיבוע לעכברים</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לדיסקציה</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה לשולחן</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

גרורה ניסויית assay

Experimental Metastasis Assay

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. כדי להבין את המנגנון של גרורות, assay גרורות ניסיוני הוקם באמצעות עכברים immunodeficient. מאמר זה מתאר את ההליכים הכרוכים assay זה, כולל הכנת המדגם, הזרקה תוך ורידית, ותאי culturing של גרורות בריאות. בקצרה, מספר שנקבע מראש של תאים סרטניים אנושיים היו מוכנים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו מוזרק ישירות לתוך מחזור הדם של עכברים immunodeficient בוורידים הזנב שלהם. מספר קטן של תאים לשרוד את הטלטלה במחזור ולגדול כמו גרורות באיברים פנימיים, כגון הריאות. הם הזריקו לעכברים גזור לאחר תקופה מסוימת. הפצה הרקמה של גרורות נקבע תחת מיקרוסקופ לנתח. מספר גרורות ברקמה מסוימת נחשבת וזה ישירות בקורלציה עם היכולת גרורתי של תאים סרטניים מוזרקים. גרורות שקמה מבודדות תרבותי<em&gt; במבחנה</em&gt; כמו שורות תאים, אשר לעיתים קרובות להראות יכולות משופרות גרורתי מ קו הורית כאשר הזריקו לעכברים immunodeficient שוב. אלה נגזרים גרורתי מאוד להיות כלי שימושי עבור זיהוי גנים או מסלולים מולקולריים המווסתים התקדמות גרורתית.

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

גרורה ניסויית Assay

גרורות הן הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. כדי להבין את מנגנון הגרורות, הוקם ניסוי למדידת גרורות...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את יכולות הגריעות של תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקה לווריד הזנב. התאים מוחזרים להזרקה בעכברים עם חסר חיסוני. לאחר מכן, התאים מוזרקים לעכברים עם חסר חיסוני, אשר יפתחו גרורות בריאות לאחר חודש עד חודשين.העכברים מנוסחים, והגרורות בריאות נספרות ומגודלות בתרבית. תוצאות של סוג זה של בדיקה מעידות על היקף הגרורות של סוג מסוים של תאי סרטן. שלום, אני סונאלי מוהאנטי מהמעבדה של ד"ר LE במחלקה לגנטיקה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר.היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע בדיקת גרורות ניסויית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור גרורות של סרטן. אז בואו נתחיל.התחילו עם תאים שהגיעו לכ-70% שקיעות (confluency). שאבו את המצע מהצלחת ושטפו בעדינות פעם אחת עם 1X PBS. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של 0.05% Trypsin. נערו בעדינות את הצלחת כדי להקל על ניתוק התאים.עקוב אחר התאים תחת מיקרוסקופ בזמן שהם ניתקים. הוסף נפח מספיק של מצע הכולל FBS כדי לעצור את פעילות ה-trypsin. לאחר מכן, העבר את התוכן למבחנה של 50 milliliter.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר שנקבע הריכוז, סבבו בצנטריפוגה בכ-200 ×g למשך שלוש דקות, מבלי להפריע למשקע התאים. הסירו בזהירות את המצע וסבבו מחדש בנפח מתאים של תמיסת Hank's balance buffer solution או HBSS כדי להגיע לריכוז סופי של כ-5 × 10⁶ תאים למילליטר.בשלב הבא, סנננו דרך מסנן תאים של Falcon בעובי 70 מיקרומטר. כדי להסיר מקבצי תאים גדולים, הניחו את קצה הפיפטה ישירות על המסנן, המוצב מעל מבחנת תרבית של חמישה מיליליטר. דחפו במהירות את התוךית דרך המסנן אל תוך המבחנה.ספרו את התאים שוב באמצעות trypan blue כדי לקבוע את החיוניות. החיוניות צריכה להיות גבוהה מ-90% לפני ההזרקה. לאחר מכן, דללו לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶ תאים למילליליטר.יש לשמור על קרח. תפסו בעדינות את זנבו של עכבר עם חסר חיסון ומשכו אותו אל תוך המגביל לעכברים, כך שגבו יישען על החריץ וזנבו יבלוט מהפתח הקטן שבחלק האחורי. החליקו באיטיות את הטבעת פנימה לאורך החריץ.ברגע שהטבעת תופסת את פיו של העכבר, נעלו אותה במקומה. העכבר לא צריך להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אך קצב הנשימה שלו צריך להישאר רגיל. אתרו את ורידי הזנב הראשיים.ארבעה כלי דם עיקריים נמצאים בזנב של עכבר. העורקים ממוקמים בצדדים הגבי (dorsal) והבטני (ventral) של הזנב. הוורידים ממוקמים בצדדים הלטרליים.שאבו לפחות 200 µL מהתאים שהוכנו לתוך מזרק של 1 mL. חברו מחט דקה בכי মাপ 30 ודחפו החוצה בועות אוויר. הנפח הסופי במזרק צריך להיות 200 µL.הכינו את הדגימה להזרקה אל הקצה הדיסטלי של הזנב. כך, אם הניסיון הראשון ייכשל, ניתן יהיה להשתמש באזור פרוקסימלי יותר של הזנב לניסיון שני. לאחר ניגוב אתר ההזרקה ב-70% ethanol, משכו את הזנב למצב ישר.החזקו את הטיפ באמצעות האגודל ותמכו בנקודת ההזרקה באמצעות האצבע. הכניסו את המחט לווריד והזריקו את התאים. ודאו שהמחט והמזרק מקבילים לווריד במהלך ההזרקה.אחרת, המחט תחדור דרך דופן כלי הדם והתאים יוזרקו לרקמות הזנב הסמוכות. הוצא את המחט אם הפרוצדורה הצליחה. דם אמור לזרום מאתר ההזרקה.הצמד כדור צמר גשים נקי כדי להקל על ניקוי השאריות, ובצע מישוש (palpation) של הזנב כלפי מעלה כדי לדחוף כל דגימה שנותרה אל תוך מחזור הדם. שחרר את העכבר מהמכשיר למניעת תנועה והחזר אותו לכלוב. רשום במחברת המעבדה את מספר ניסיונות ההזרקה ואת מספר התאים שהוזרקו.קבעו את חיות התאים לאחר ההזרקה. כפי שצוין קודם לכן, שלב זה מספק ביטחון בכך שהתאים נשארים בחיים לאורך תהליך ההזרקה. בסיום ניסוי ההזרקה, חיות התאים תרד, אך היא אמורה להישאר מעל 80%. כשלב אופציונלי, סובבו (spin down) את התאים הנותרים ושטפו את המשקעים ב-PBS פעם אחת.לאחר מכן, הקפיאו את המשקעים במינוס 80 מעלות צלזיוס (80°C-) לצורך אנליזות עתידיות, כגון western blotting. כדי לאשר ביטוי גנים ב-knockdowns, לאחר חודש עד חודשיים, בצעו נתיחה של העכברים כדי לקבוע את מיקומי הגרטורות. התחילו במיקום העכבר שהורג על תחנת נתיחה.רססו את העכבר בנדיבות באתנול. חתכו את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות והלב. לאחר מכן, הוציאו אותם בזהירות והניחו אותם ב-PBS.הריאה היא האתר העיקרי לגרורות מאחר שהיא מכילה את מיטת הנימים הראשונה שהתאים פוגשים. לאחר כניסתם למחזור הדם, הסירו את הלב ושטפו את הריאות ב-PBS, ולאחר מכן בחנו כל אונה של הריאה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. ספרו את מספר הגרורות הניתנות לזיהוי בשני צדי הריאה, ולאחר מכן סכמו את מספר הגרורות בכל ארבע האונות יחד כדי לקבוע את המספר הכולל של גרורות בריאות.בשלב הבא, בודדו גרורות ריאה בודדות באמצעות כריתה עם מספריים. העבירו כל גרורה למסננת תאים של 70 מיקרומטר וקטעו אותה באמצעות קצה של מכסה מחט סטרילי. שטפו את מסננת התאים עם מספר מיליליטרים של מצע ואספו את התאים שעברו דרך המסנן.בתוך צלחת תרבית, כאשר כל צלחת מכילה תאים מגרורה אחת. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבעה ימים לפחות ללא הפרעה. בתחילה, הן תאי הסרטן והן תאי הפיברובלסטים יגדלו על הצלחות, אך בהדרגה תאי הפיברובלסטים ימותו ויוחלפו על ידי תאי הסרטן.אם תאי הסרטן נושאים גנים העמידים לתרופות, בחר את התאים באמצעות האנטיביוטיקה המתאימה. לאחר שלושה ימים, שטוף בעזרת PBS שאריות דם או רקמה מהצלחת והוסף מצע טרי. העריך את טוהר התאים המופקים באמצעות צביעה אימונולוגית עם נוגדנים לחלבונים ספציפיים לאדם; במקרה זה נעשה שימוש בנוגדן anti-human גם בהיעדר ברירה באמצעות תרופות. יותר מ-99% מהתאים צריכים להיות אנושיים.ניתן כעת להזריק שוב את התאים שהופקו למשכי עכברים עם חסר חיסוני כדי לבחון את יכולות הגרירה המטסטטית שלהם בסיום בדיקה זו. שורת תאי סרטן בעלת פוטנציאל מטסטטי גבוה תגרום בדרך כלל להיווצרות גרורות רבות בריאות, בעוד ששורת תאי סרטן בעלת פוטנציאל מטסטטי נמוך תגרום להיווצרות גרורות מעטות מאוד בריאות. תמונות אלו מציגות גרורות בריאות חודשיים לאחר הזרקה של שורת תאי מלנומה אנושיים.A 3 7 5 sm. תאים שהופקו בשיטה זו גורמים בדרך כלל ליותר גרורות מאשר השורה ההורית כאשר הם נבדקים. שוב באמצעות בדיקה זו, הצגנו בפניכם את הפרוצדורה לביצוע בדיקת גרורות ניסויית.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור לוודא שהתאים מוזרקים לווריד הזנב, אך לא לרקמות הזנב. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים...

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לביסוס מודל עכבר גרורות ספונטני של קסנוגרפטים או PDX שמקורם בסרטן המעי הגס. מודלים אלה של xenograft מחקים חלקית את המאפיינים של קרצינומה אנושית ומבינים את ההיבטים הקריטיים של ממאירויות אנושיות, כולל פלישה וגרורות.

מודלים ספונטניים של גרורות בעכבר: פלטפורמה לחקר הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן המעי הגס בהזרקה אורתוטופית

מודל orthotopic זה של סרטן הערמונית אנושי מאפשר כימות של גודל גידול, תאים סרטניים במחזור, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. ככל שתאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, להזין את זרם הדם, ולהשתיל לאתר משניים, מודל זה ביעילות משחזר את התרחיש בבני אדם.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

גרורות ממלאת תפקיד משמעותי באלימות הסרטן, ומהווה כ-90% ממקרי המוות.  אנו מדווחים על פרוטוקול למודל מלנומה גרורתית בעכברים השימושי לקביעת יעילותם של חומרים טיפוליים כנגד תופעה קלינית זו.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

למדו שיטה להערכת פוטנציאל גרורה של תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקה לווריד הזנב בעכברים חסרי חיסון. שיטה זו מאפשרת כימות גרורות ריאה ותרבותן לניתוח נוסף.

גרורה ניסויית Assay

גלה סרטונים נוספים