גרורה ניסויית Assay
24 באוגוסט 2010
מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את היכולות הגרורתית של תאים סרטניים אנושיים על ידי הזרקות לווריד הזנב. בעכברים חסרי חיסון, התאים מוכנים להזרקה. לאחר מכן מוזרקים התאים לעכברים חסרי חיסון, אשר ייצרו גרורות ריאה לאחר חודש עד חודשיים.
העכברים מנותחים וגרורות ריאות מכומתות ומתורבתות. תוצאות של בדיקה מסוג זה מצביעות על היקף הגרורות של סוג מסוים של תא סרטני. היי, אני סונאלי מוהנטי מהמעבדה של ד"ר LE במחלקה לגנטיקה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר.
היום נראה לך נוהל לביצוע בדיקת גרורות ניסיונית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור גרורות סרטניות. אז בואו נתחיל.
התחל עם תאים שגדלו לכ-70% Co fluency, שאב מדיה מהצלחת ושטוף בעדינות פעם אחת עם XPBS אחד. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 0.05% היפוך טריפסין. נדנד בעדינות את הצלחת כדי להקל על ניתוק התאים.
התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כשהם מתנתקים. הוסף נפח גדול של מדיה המכילה FBS כדי להרוות את הנסיעות בפעילות. לאחר מכן מעבירים לצינור של 50 מיליליטר.
ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו. לאחר קביעת הריכוז, צנטריפוגה בערך פי 200 מכוח הכבידה למשך שלוש דקות מבלי להפריע לכדור התא. הסר בזהירות את ה-Media Resus המשהה נפח מתאים של תמיסת חיץ האיזון של האנק או HBSS כדי להגיע לריכוז סופי של בערך פי חמישה פי 10 לששת התאים למיליליטר.
לאחר מכן, סננו דרך מסננת התאים של פלקון בקוטר 70 מיקרומטר. כדי לא לכלול אגרגטים של תאים גדולים, הנח את קצה הפיפטה ישירות על המסנן, המונח מעל צינור תרבית של חמישה מיליליטר. הוצא במהירות את המתלה דרך המסנן לתוך הצינור.
ספור את התאים שוב באמצעות טריאן כחול כדי לקבוע את הכדאיות. הכדאיות צריכה להיות גדולה מ-90% לפני ההזרקה. לאחר מכן יש לדלל לריכוז סופי של 2.5 כפול 10 לששת התאים למיליליטר.
המשיכו על הקרח. תפוס בעדינות את זנבו של עכבר חסר חיסון ומשוך אותו לתוך ריסון העכבר כשגבו אל החריץ וזנבו בולט החוצה מהפתח הקטן מאחור. החלק לאט את הטבעת פנימה לאורך החריץ.
ברגע שהטבעת תופסת את פיו של העכבר, נעל אותו במקומו. העכבר לא אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אך צריך להיות בעל קצב נשימה תקין. מצא את ורידי הזנב העיקריים.
ארבעה כלי דם עיקריים נמצאים בזנב עכבר. העורקים ממוקמים בצד הגב והגחון של הזנב. הוורידים ממוקמים בצדדים הרוחביים.
שואבים לפחות 200 מיקרוליטר מהתאים המוכנים למזרק של מיליליטר אחד. חבר חצי מחט בגודל 30 ודחף החוצה את כל בועות האוויר. הנפח הסופי במזרק צריך להיות 200 מיקרוליטר.
התכוננו להזרקה לקצה הדיסטלי של הזנב. כך שאם הניסוי הראשון נכשל, ניתן להשתמש באזור קרוב יותר של הזנב לניסיון שני. לאחר ניגוב מקום ההזרקה עם 70% אתנול, משוך את הזנב ישר.
החזק את הקצה עם האגודל ותמוך בנקודת ההזרקה עם האצבע המורה. הכנס את המחט לווריד והזריק את התאים. ודא שהמחט והמזרק מקבילים לווריד במהלך ההזרקה.
אחרת, המחט תחדור דרך דופן הכלי ותאים יוזרקו לרקמות הזנב הסמוכות. משוך את המחט אם ההליך עבר בהצלחה. הדם אמור לחלחל ממקום ההזרקה.
לחצו על צמר גפן נקי כדי להקל על השימוש בחוט דנטלי ומישוש את הזנב כלפי מעלה כדי לדחוף כל דגימה שנותרה למחזור הדם. שחרר את העכבר מהמסנן והחזיר אותו לכלוב. רשום את מספר ניסויי ההזרקה ואת מספר התאים שהוזרקו במחברת מעבדה.
קבע את כדאיות התאים לאחר ההזרקה. כמו קודם, שלב זה מספק ביטחון שהתאים נשארים בחיים לאורך כל תהליך ההזרקה. בסוף ניסוי ההזרקה, כדאיות התאים תפחת, אך צריכה להישאר מעל 80%כשלב אופציונלי, סובב את התאים הנותרים ושטוף את הכדורים עם PBS פעם אחת.
לאחר מכן הקפיאו את הכדורים במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים כגון כתמים מערביים. כדי לאשר את ביטוי הגנים בנוקדאונים לאחר חודש עד חודשיים, נתחו את העכברים כדי לקבוע את מיקומי הגרורות. התחל בהנחת העכבר המורדם על תחנת דיסקציה.
מרססים את העכבר בנדיבות באתנול. חותכים את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות והלב. לאחר מכן כרתו אותם בזהירות והניחו אותם ב-PBS.
הריאה היא האתר העיקרי לגרורות מכיוון שהיא מכילה את מצע הנימים הראשון שהתאים נתקלים בו. לאחר שהם נכנסים למחזור הדם, הסר את הלב ושטוף את הריאות ב-PBS ואז התבונן בכל אונה של הריאה תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר הגרורות הניתנות לזיהוי משני צידי הריאה, ולאחר מכן את מספר גרורות הריאות בכל ארבע האונות יחד כדי לקבוע את המספר הכולל של גרורות ריאה.
לאחר מכן, בודד גרורות ריאה בודדות על ידי כריתה באמצעות מספריים. העבירו כל גרורה למסננת תאים של 70 מיקרומטר וטחנו אותה באמצעות קצה מכסה מחט סטרילי. שוטפים את מסננת התאים בכמה מיליליטר מדיום ואוספים את התאים העוברים דרך המסנן.
בצלחת תרבית, כל מנה מכילה את התאים מגרורות אחת. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים לפחות ללא הפרעה. בתחילה, גם תאי סרטן וגם תאי פיברובלסטים יגדלו על הצלחות, אך בהדרגה תאי הפיברובלסטים ימותו ויוחלפו בתאים סרטניים.
אם תאי הסרטן נושאים גנים עמידים לתרופות, בחר את התאים עם אנטיביוטיקה מתאימה לאחר שלושה ימים, שטפו את כל שאריות הדם או הרקמות, הפסולת על הצלחת עם PBS והוסיפו מדיום טרי. העריכו את טוהר התאים הנגזרים על ידי צביעה חיסונית בנוגדנים כנגד חלבונים ספציפיים לבני אדם כאן ונעשה שימוש בנוגדנים אנטי-אנושיים גם בהיעדר בחירת תרופות. יותר מ-99% מהתאים צריכים להיות אנושיים.
כעת ניתן להזריק את התאים החדשים שהופקו שוב לעכברים חסרי חיסון כדי לבחון את יכולותיהם הגרורניות בתום בדיקה זו. קו תאי סרטן גרורתי מאוד מוליד בדרך כלל גרורות ריאות רבות, בעוד שמעט מאוד גרורות ריאה יגיעו מקו תאי סרטן גרורתי גרורתי. תמונות אלה מראות גרורות בריאות חודשיים לאחר הזרקת קו תאי המלנומה האנושית.
א 3 7 5 ס"מ. התאים המופקים בשיטה זו בדרך כלל גורמים ליותר גרורות מאשר קו ההורים כאשר הם נבדקים. שוב באמצעות בדיקה זו, זה עתה הראינו לך את ההליך לביצוע בדיקת גרורות ניסיונית.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב מאוד לזכור לוודא שהתאים מוזרקים לווריד הזנב, אך לא לרקמת הזנב שלו. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקת גרורות ניסויית המשמשת להערכת הפוטנציאל הגרורי של שורות תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקות לווריד הזנב בעכברים עם חסר חיסוני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אונקולוגיה
- מחקר גרורות
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- הבנת גרורות סרטן היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- בדיקות ניסיוניות מסייעות בכימות הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן.
- עכברים עם חסר חיסוני מהווים מודל מתאים לחקר התנהגותם של תאי סרטן אנושיים.
- הזרקות לווריד הזנב הן שיטה נפוצה להערכת גרורות בריאות.
מטרת המחקר
- לבחון את יכולות הגרי decorator של תאי סרטן אנושיים.
- לכמת ולגדל גרורות ריאה שנוצרו מתאים שהוזרקו.
- לספק תובנות לגבי הפוטנציאל הגרי decorator של שורות שונות של תאי סרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי סרטן אנושיים להזרקה.
- הזרקת תאים לווריד הזנב של עכברים עם חסר חיסוני.
- מעקב אחר התפתחות גרורות בריאות לאורך חודש עד חודשיים.
- ניתוח עכברים לצורך כימות ובידוד לתרבית של גרורות בריאות.
תוצאות עיקריות
- הצלחה ביצירת גרורות ריאה מתאי סרטן שהוזרקו.
- כימות הגרורות מספק נתונים על הפוטנציאל הגרורתי.
- ניתן להשתמש בגרורות שגודלו בתרבית לצורך ניתוחים נוספים.
- התוצאות מעידות על שונות ביכולות הגרורתיות בין קווי תאי סרטן שונים.
מסקנות
- בדיקת הגריעות (metastasis assay) הניסוינית יעילה להערכת התנהגותם של תאי סרטן.
- התובנות שנרכשו יכולות לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות נגד סרטן גרורתי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור את המנגנונים שבבסיסם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בדיקת גרורות ניסויית מספקת מודל כמותי in vivo להערכת הפוטנציאל המטסטטי של שורות תאי סרטן אנושיים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות (target validation) והסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות לאונקולוגיה. על ידי כך שהיא מאפשרת בידוד והפצה של נגזרות בעלות פוטנציאל גרורתי גבוה, הבדיקה מקלה על זיהוי גנים ומסלולים המווסתים את התקדמות הגרורות, ובכך מספקת מידע לזיהוי מולקולות מובילות (leads) ותיעדוף פרה-קליני. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בפיתוח תרפויטי בהמשך, על ידי קישור ממצאים in vitro לתוצאות גרורתיות תפקודיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות היכולת הגרורה של תאי סרטן בעקבות הפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- ערך תפעולי: מספק מדד in vivo הניתן לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות במסלולים הרלוונטיים לגרורות.
- ערך מדעי: תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי קישור שינויים מולקולריים לפנוטיפים גרורתיים בעכברים עם מערכת חיסונית לקויה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר ספירות כמותיות של גרורות המשמשות כמשתנים תלויים לסריקת מודולטורים של התפשטות גרורתית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הליכי הכנת תאים, הזרקה וקצירת רקמות כדי להבטיח הדירות בין ניסויים.
- ערך מדעי: מאפשר גזירה של שורות תאים גרורתיות עם תכונות פולשניות מוגברות לשימוש בסריקה משנית ובדה-קונבולוציה של מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משתמש במערכת רלוונטית למחלה שבה היווצרות גרורות בריאות משקפת דפוסים קליניים של התפשטות המטוגנית.
- ערך תפעולי: תומך במחקרים אורכיים על ידי מתן אפשרות להזרקה חוזרת של גרורות שגודלו בתרבית כדי להעריך את היציבות של הפנוטיפ הגרורתי.
- ערך מדעי: מסייע בגילוי סממנים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לאפיון מולקולרי של גרורות מבודדות בהשוואה לקווים הוריים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משמשת ככלי בשלב הגילוי המגשר בין בדיקת היפותזת המטרה לבין תיקוף פנוטיפי, ובכך היא מספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי קידום תרכובות ומעקב מכניסטי במסלולי פיתוח בתחום האונקולוגיה.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקה מונחית-השערה של ווסתי גרורות באמצעות בדיקות כמותיות של התנחלות בריאות.
- סריקה: מספק תוצאות סטנדרטיות וכמותיות (מספר הגרורות לריאה) המאפשרות השוואה בין תנאים גנטיים או כימיים.
- אנליטיקה: מייצר נתונים מבוססי ספירה המתאימים לניתוח סטטיסטי לקביעת הבדלים משמעותיים בפוטנציאל הגרורתי.
- מחקר טרנסלציוני: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לוולידציה פרה-קלינית על ידי אספקת מודל המשקף טרופיזם גרורתי ספציפי לאיבר.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת יכולת גרורתית במגוון סוגי סרטן ובשיטות טיפוליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במבחר המטרה על ידי הדגמת קשרים סיבתיים בין מודולציה של גנים לבין דיכוי או הגברה של גרורות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות ספי הלמינויות תאים סטנדרטיים (>90% לפני הזרקה, >80% לאחר הזרקה) ונפחי הזרקה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פונקציונליים על גרורות המשלבים בדיקות פלישה ושגשוג in vitro.
- השפעה על תיק המטרות (Portfolio Impact): מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעתן המוכחת על עומס הגרורות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים, בטכניקות של הזרקה תוך-ורيدية ובניתוח רקמות אספטי.
- תלוי בגישה למודלים של עכברים עם חסר חיסוני ובמתקנים לאכסון בעלי חיים לטווח ארוך (חודש עד חודשיים).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תאים, להערכת חיות ולכימות גרורות כדי למזער שונות.
- כולל שיקולים טכניים לבידוד גרורות, כולל דיסוציאציה אנזימטית או מכנית וסינון להשגת תרביות של תאים בודדים.
- מוגבל למידול של הפצה מוקדמת והתנחלות בריאות; אינו לוכד שלבים מאוחרים יותר של גרורות, כגון extravasation או צמיחה באיברים מרוחקים מעבר לריאה.
