Name: חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: חקור חילוץ DNA מחיידקי מעי הטרמיט Zootermopsis angusticollis ויזואליזציה של קהילת המיקרובים הגוטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מסלולי מטבוליזם אנרגיה ואקולוגיה מיקרוביאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סיכום פרוצדורלי להפקת שלם במעי טרמיטים DNA: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרמיטים צ&#39;יל על הקרח, להסיר במעיים באמצעות פינצטה סטרילי ולייצב דגימות המעיים במאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize דגימות PVPP / SDS / חיץ פנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ולטהר דנ&quot;א lysate גולמי באמצעות Qiagen עמודות DNeasy. </li></ol> פרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קרח, להסיר את האומץ של כת טרמיטים עובד באמצעות מלקחיים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את אומץ התכנים צינור סטרילי nuclease חינם, המכיל 50 μL קר כקרח 1x ביולוגיה מולקולרית כיתה TE חיץ (1 mM טריס-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). להקפיא דגימות -20 ° C, או להמשיך ישירות עם homogenization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות המעי חיץ צינור סטרילי, nuclease ללא מ&quot;ל 2 בורג כתרים טעון מראש עם 500 מ&quot;ג של zirconia / סיליקה חרוזים סטרילית (0.1 מ&quot;מ) ו - 700 μl של חיץ TE 1x המכיל 1% w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של סולפט 20% נתרן dodecyl (SDS) ו - 500 μl של פנול על דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize (פעימה חרוז) על הגדרת הגבוהה ביותר באמצעות שלושה מחזורים של 30 שניות homogenization ו 30 שניות של מצמרר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקעים חומר מסיס 1 דקות ב 8000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר 300 μl aliquots של השכבה (העליון) מימית עם עמודות Qiagen DNeasy בשיטה המתוארת לטיהור lysate גולמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תוכן חומצות גרעין דגימות להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

מניסיוננו, DNA המופק הקהילות מיקרוביאלי של עץ האכלה מינים טרמיטים כמו nevadensis Zootermopis טהור מספיק עבור תבנית PCR לאחר סבב אחד של מיצוי וטיהור. עם זאת, כמה טרמיטים כגון האכלה, המלטה ואדמה האכלה המינים יכולה להיות ריכוז גבוה של חומצות humic של תוכן המעיים שלהם והן עשויות לחייב טיהור נוסף של ה-DNA של חיידקים במעיים. התשואה DNA הכולל את הקרביים של 5 עובדים צ&#39;nevadensis הוא בטווח של 10-30 מיקרוגרם. עבור מינים טרמיטים משמעותית קטן או גדול יותר ממין זה, דגימות יותר או פחות עשוי להיות נחוץ כדי להשיג...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/phenol</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>בופר הומוגניזציה</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>ערכה</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>בשימוש בהתאם לפרוטוקול לבידוד DNA גנומי מליזאטים גולמיים (נספח H, גרסת מדריך המוצר: יולי 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>בופר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>בופר 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) מריכוז של 100x</td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניה/סיליקה</td><td>ציוד עזר</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v polyvinylpolypyrrolidone שהוכן מריאגנט יבש כתליה של 1x בבופר TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>בעל חיים</td><td></td><td></td><td>טרמיטים</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>תמיסת Sodium dodecyl sulfate 20% במים מריאגנט יבש</td></tr><tr><td>פנול</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>רווי TE, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>כלי</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>תמיסת מלחים עם בופר, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>הרכב לליטר: 2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, ו-10 mL של תמיסת 1 M של NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>מאובזר בעדשה אובייקטיבית 40x, optivar 1.6x ועדשות אוקולריות 10x. הדגימות נבחנו באמצעות תאורה בניגודיות פאזה (phase contrast)</td></tr></tbody></table>

חילוץ ה-dna של חיידקים במעיים של טרמיטים (zootermopsis angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

הטרמיטים הם בין החיות כמה שידוע יש את היכולת להתקיים אך ורק על ידי עץ רב. בדרכי המעיים טרמיטים מכיל אוכלוסייה צפופה של חיידקים מינים עשיר המסייע השפלה של lignocellulose בעיקר לתוך אצטט, מרכיב מפתח תדלוק מטבוליזם טרמיטים (Odelson &amp; Breznak, 1983). בתוך אלה אוכלוסיות חיידקים הם חיידקים קדומים methanogenic, ובחלק (&quot;נמוך&quot;) טרמיטים, אוקריוטים פרוטוזואה. לפיכך, טרמיטים הם נושאי מחקר מעולה לחקר יחסי הגומלין בין מינים של חיידקים ושל פונקציות ביוכימיים רבים שהם מבצעים לטובת המארחות. הרכב זנים של אוכלוסיות חיידקים במעיים טרמיטים וכן הגנים המרכזיים המעורבים בתהליכים ביוכימיים שונים נחקר תוך שימוש בטכניקות מולקולריות (Kudo et al, 1998;. Schmit-וגנר et al, 2003;. Salmassi &amp; לידבטר, 2003). טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (מור et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).

וידאו זה מדגים את הטכניקה להפקת DNA של זנים של חיידקים במעי האחורי תושב טרמיטים. ההכנה של שקופית הר רטוב, אשר הוא שימושי עבור לדמיין את הקהילה חיידקים במעיים מודגם גם, סיור דרך הסביבה, מינים עשיר הבטן הוא נתון.

חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

טרמיטים הם מהבעלי החיים הבודדים הידועים כבעלי היכולת להתקיים אך ורק מצריכת עץ. צינור העיכול של הטרמיט מכיל אוכלוסייה צפופה של...

כאן, התגובה שלך לסביבה הזו אינה, אינה ייחודית. רוב האנשים, אפילו מי שאינם מדענים, הם, הם די נדהמים. כן. מהגיוון והמורכבות.שלום, שמי אריק מאטסון ואני פוסט-דוקטורנט במחלקה להנדסה סביבתית ומדעית כאן במכון הטכנולוגי של קליפורניה. עבודתי, תחת הנחייתו של פרופסור ג'ארד לדבטר, מתמקדת באינטראקציות המיקרוביאליות ובמגוון המינים השוכנים במעי האחורי של הטרמיט. באופן ספציפי, אנו מעוניינים בחלק מהמסלולים הביוכימיים המתרחשים שם, ובמיוחד בתהליך ה-acetogenesis, שבו מיקרובים אלו צורכים גזים של מימן ו-CO2 וממירים אותם לאצטט, המהווה חומר הזנה מרכזי במטבוליזם האנרגטי של הטרמיט המארח.אני ועמיתיי במעבדה פיתחנו סטים של פריימרים ספציפיים כדי שנוכל לבחון אנזימי מפתח במסלול זה. אך כדי לעשות זאת, עלינו להפיק דגימות DNA נקיות של קהילת המיקרוביום, כדי להשתמש בהן כמטרות לתהליך זה. לכן, היום רציתי להדגים כיצד אנו מנתחים את מיני הטרמיטים שבהם אנו עוסקים, מבודדים את ה-DNA מהמעי האחורי ולאחר מכן מטהרים אותו לשימוש עתידי במחקרי המשך.היום נתמקד במין אחד של טרמיט, שנקרא במיוחד Zo Opsis Nevadensis. זהו טרמיט עץ לח של קליפורניה שנאסף באופן מקומי כאן, וזהו מין גדול למדי, מה שהופך את ביצוע הניתוחים והחילוצים ממנו לקלים למדי. אוקיי, כך שהיום כבר הכנתי חלק מהציוד שנצטרך לצורך הפרוצדורה.אחד הדברים הראשונים שנצטרך הוא כמות מסוימת של קרח כדי לקרר את החרקים שנבצע בהם את הנתיחה. קררתי מראש גם תמיסת TE, המכילה תרכובת שתסייע בייצוב ה-DNA לאחר שחרורו מהתאים. הכנתי מבחנות סטריליות המכילות חרוזי זירקוניה סיליקט.אלו הן חרוזים בגודל 0.1 מילימטר ויש כאן כחצי גרם בערך. זהו השלב שנבצע בפועל, גזירה מכנית. בנוסף, יש לי מספר ריאגנטים המשמשים להליך הליסיס והטיהור.כאן יש לי בקבוק המכיל 1% polyvinyl PolyOne או PVPP בתוך תמיסת בופר. ה-PVPP חשוב להסרת חומצות הומיות מההכנות של ה-DNA, שכן אלו עלולות לעכב את אנליזת ה-PCR של התוצאות. בנוסף, יש לי נתרן דודציל סולפט (sodium dodecyl sulfate), שהוא חומר פעילי שטח שנשתמש בו כדי לסייע בהפקה ובפירוק של התאים.ולביצוע הדיסקציה של הטרמיטים, כל שעלינו להשתמש בהן הן פינצטות סטריליות. אלו הן בעלות חוד דק למדי, ובעזרתן נסיר את נתיבי המעי. ולבסוף, לביצוע הגזירה המכנית, יש לנו כאן מכשיר Bead Beater המסתובב ב-RPM גבוה מאוד, והוא, יחד עם חרוזי זירקוניה סיליקט, יבצע את הפירוק המכני של התאים.לאחר שאספנו את הטרמיטים בשטח, אנו מביאים אותם לכאן למעבדה. מרבית הטרמיטים של העץ הלחי (California damp wood termites) שאנו עובדים איתם נוטים מאוד להתייבשות. לכן, אחת ההתפתחויות שהשגנו במעבדה זו היא שילוב של תאי בקרה עם לחות מבוקרת, כגון אקווריומים אלה בנפח 10 גלון.כאן אנו אוספים את המושבות הבודדות ושומרים אותן מופרדות בתוך הקופסאות הללו. בבסיס המכל נמצאים למעשה מכלים המכילים תמיסות מלח שונות. המכל הספציפי הזה מכיל תמיסה של potassium phosphate, השומרת על לחות יחסית של כ-95% עד 96%, דבר שהוא אידיאלי.ובתנאים אלה, הצלחנו לגרום לטרמיטים להתרבית למעשה בשבי, אך כאשר אנו מעוניינים לבצע ניסוי, אנו אוספים אותם טריים מהשטח. בתיבה זו תוכלו לראות חלק מהעץ שהם ניזונים ממנו. זהו פשוט אורן פונדרוזה או אורן ג'פרי שאנו אוספים באתר של קן הטרמיטים.קיימות מספרה שלהקות טרמיטים שונות, הכוללות את הזכרים והנקבות הרבים. מרבית המושבה מורכבת מטרמיטים פועלים, לצד מספר של טרמיטים מסוג חיילים. מעניין לציין כי לחיילים יש חלקי פה, מנדיבולים, המיועדים להגנה על המושבה ולא לאכילת העץ.וכך הם תלויים בטרמיטים הפועלים כדי להזין אותם גם כן. לכן ניתן לראות בתיבה זו הן פועלים והן טרמיטים חיילים, כמו גם כמה צעירים שבקרו לאחרונה מביצים, כאן בשבי.בחרתי חמישה טרמיטים פועלים מהקבוצה שהראיתי לכם זה עתה. התחלתי בקירורם כאן על קרח. כדי להתכונן לנתיחה, אשתמש בפינצטות אלו ואעבוד בעזרת מיקרוסקופ נתיחה, ובתקווה שתוכלו לראות את נפח המעי הגדול שנוכל להוציא מכל אחד מהפרטים הללו.פשוט הפכו את הטרמיט על גבו ובאמצעות פינצטה אחת החזיקו את קצה הראש, ובאמצעות השני פשוט לחצו. בדיוק בקצה הבטן כאן. ובמשיכה אחת, אתם אמורים לראות את תעלת המעי נשלפת מהאורגניזם. אוקיי.ניתן לראות את הנפח הגדול, בערך 30%–40% ממשקלו של חרק, שכלול למעשה בתוך הסביבה הזו. ניתן לראות כי היא מחולקת למספר חלקים: המעי הקדמי, המעי האמצעי, ואז חלק המעי האחורי, שהוא חלל גדול מאוד המכיל את רוב הקהילה המיקרוביאלית המבצעת את התסיסות.כאן הסרתי את האיברים הפנימיים של חמש טרמיטות פועלות. השלב הבא הוא ייצוב החומצות הגרעיניות הכלולות בקהילה כאן, בתוך תמיסה של TE buffer קרה מאוד. בשלב זה, ניתן להקפיא אותן בטמפרטורה של 20- מעלות Celsius אם אתם עובדים בשטח.או שנוכל להמשיך ישירות להליך המיצוי. אך כל התאים וחומר ה-DNA עדיין נמצאים בתוך המעי. ואני פשוט אעביר אותם ל-100 µL של תמיסת TE.בסדר, לפני שאני מתחיל למעשה בהפקה מהדגימות של המעי, אני צריך להכין את הבאפר שבו אשתמש כדי לפרק את התאים והרקמות. לתוך המבחנה הזו, שבה כבר יש כ-half gram של חרוזי זירקוניה, אני אוסיף PVPP בנפח של 700 µL; זהו תמיסה של 1% ב-TE buffer, וכן 50 µL של תמיסת SDS בריכוז של 20%.חשוב לערבב מחדש את ה-PVPP לפני ההוספה, כיוון שהוא אינו ממיס במגבים מימיים. בשלב זה, אנו מוכנים להוסיף את הפנול לדגימה, לכן אשתמש בפיפטה כדי להוסיף כ-500 µL. בסדר. וכך, אנו מוכנים להתחיל בתהליך המיצוי.לאחר הוספת הפנול, אנו מוכנים להוסיף את דגימת המעי שהוצאנו קודם לכן מהטרמיט, שכן הדבר מסייע בריסוק קל של הרקמות. פעולה זו נוטה להקל באופן מה שמעט על ההעברה. וכעת, כאשר הפנול הוסף, אנו מוכנים להתחיל בפירוק מכני באמצעות מכשיר ה-bead beading.הטכניקה שבה נשתמש היא שלושה מחזורים במהירות מלאה, למשך 30 שניות, ולאחריהם 30 שניות על קרח. חשוב לשלב את השלב על קרח כדי להkריר את הדגימה, כיוון שהיא נוטה להתחמם עקב חיכוך. לכן, אני פשוט אכניס את הדגימה למכשיר הריסוק בחרוסיים כאן, ואפעיל אותו למשך 30 שניות. בסדר.בסיום הפרוצדורה, ניתן לראות שרוב הרקמה עברה הומוגניזציה. אמורים להישאר מעט מאוד גושים, וניתן להבחין במראה קצפי, ככל הנראה בשל נוכחות ה-SDS. בשלב זה, ניתן לבצע סנטריפוגציה ולהתחיל בתהליך ההפקה והטיהור של ה-DNA עצמו מדגימה זו.כעת, לאחר שביצענו הפרעה מכנית לתאים, נסpin את החומר הבלתי מסיס באמצעות צנטריפוגה. נעשה זאת על ידי הנחת הדגימה בצנטריפוגה והפעלה של 8,000 ×g למשך דקה אחת. כעת אנו מצפים לראות את רוב החומר המסיס נאסף קרוב לתחתית המבחנה.מה שמעניינו הוא התמיסה המימית בחלק העליון. זהו החלק שנוסיף בפועל לערכה להוצאת DNA של KaiGen, בהתאם לנוהל עבור ליזאט גולמי. כעת, לאחר שסבבנו את הדגימות בצנטריפוגה, ניקח 200 µL של העילוי עבור כל דגימה, ונחלץ את ה-DNA באמצעות ערכת A-D-N-E-Z של KaiGen, לפי הפרוטוקול המיועד לליזאט גולמי.כעת יש בידינו 200 µL של דגימת מעי, ואני אמשיך להשתמש בערכה d easy של kyogen על פי הפרוטוקול המיועד לליסאט גולמי. בכל פעם שאנו מבצעים מיצוי מהמעי, תמיד כדאי לבדוק את מצב תכולת המעי. אנו עושים זאת על ידי נתיחה של טרמיט כדי לוודא שהדגימה מייצגת את מה שראינו בעבר.נבצע זאת בפועל באופן ויזואלי על ידי בחינת התאים בקהילה מיקרובית זו. ממש בקצה הבטן כאן. ובעזרת קוטב אחד, תוכלו לראות את תעלת המעי.זהו פשוט תמיסת מלח עם בופר שמרכיביה דומים מאוד להרכבו של נוזל המעי בפועל של התרמית. אני רק אמעך את זה מעט, ואז אוסיף זאת לסמיכה של המיקרוסקופ ונבחן את הדברים. אוקיי, כעת אנו מוכנים לבחון זאת במיקרוסקופ.כן, זה נראה ממש טוב. מעי של טרמיט. ישנם נציגים של כל שלושת דומייני החיים המוכרים.קיימים פרוטואזואים אוקריוטיים, קיימים אורגניזמים אחרים, וקיימים גם חיידקים. המעבדה שלנו עוסקת בעיקר באוכלוסיית החיידקים בסביבה זו. ובפרט ב-SPI, אשר בסוג זה של תלי טרמיטים, הם מהחברים הבולטים ביותר בקהילת החיידקים.ומחקרינו הנוכחיים מראים כי למעשה הם אכן משתתפים במידה רבה ב-CO2 reductive acetogenesis. אלו הם סוגים שונים של protozoa, והם נחשבים כמשתתפים בפירוק הראשוני של עץ. לפיכך, ההנחה היא שהם מכילים xylanases ו-cellulase המאפשרים לאנזימים שלהם גישה לפולימרים של העץ.ואז הם מתססים אותם למונומרים של סוכר יחיד ופולימרים שמתפרקים בהמשך על ידי חברים אחרים בקהילה. פרוטואזואים אלו מייצרים גם הם אצטט, אך אחד מתוצרי הלוואי שלהם הוא מימן ו-CO2, ומימן ו-CO2 אלו הם שוב מה שנצרק על ידי אוכלוסיות האצטובקטריים בסביבה זו. וכאן ניתן לראות נחיל של אורגניזמי פרוטואזואה, ככל הנראה ממש לצד מין גדול מאוד של טריקומונאס שם.זהו אחד האורגניזמים הגדולים ביותר במעי הטרמיט. כאשר יורדים ומסתכלים בפועל על אזורים שאינם מכילים את תאי הפרוטואזואה הגדולים הללו, ניתן לראות שהרקע, סוג זה של נוזל בינתיים, עמוס גם הוא ב-Spirochaetes ובתאי חיידקים אחרים. לכן, המורכבות אינה פוחתת אפילו במרחבים הללו.אחד הדברים שעלי לציין הוא שהנפח הטיפוסי של דגימת המעי האחורי, כגון זו שבחנו כאן, הוא בין 2 ל-5 µL, בהתאם לגודל הטרמיט. לכן, הכנת התכשיר הרטוב (wet mount) שהכנתי כאן מייצגת למעשה דילול של לפחות 1:20 של סביבה זו. לפיכך, מינים אלו דחוסים בפועל בצפיפות גבוהה הרבה יותר במעי השלם מאשר מה שמוצג כאן.זה נותן לכם מושג לגבי הצפיפות וכן לגבי מגוון החיים בסביבה זו. היום הראיתי לכם כיצד אנו מבודדים את ה-DNA ממעיי הנמלה עם הדגימות המזוקקות הללו. כעת נוכל להשתמש בסטים ספציפיים של פריימרים ממוקדים.במילים אחרות, נבחן גנים עבור form a dehydrogenase, carbon monoxide dehydrogenase, ו-formal tetra hydro folate synthesis, שהם שלושה מזוגות הפריימרים שהמעבדה שלנו פיתחה. אנו מעוניינים לחקור את השונות ואת מאפייני הרצף הספציפיים של מספר גנים שונים אלו בסביבה זו. הדבר יכלול הגברה של הגנים השונים באמצעות PCR, שיבוט שלהם, ריצוף שלהם ובניית מלאי גנים.על סמך התוצאות, ניתן ללמוד על אופיין של חלק מהאינטראקציות הללו, ובמיוחד על האופן שבו מסלולים אלו נבנים במיקרואורגניזמים השונים באמצעות תהליך זה.

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ג'ארד לידבטר מסביר מדוע הקהילה טרמיטים חיידקים במעיים היא מערכת מצוינת ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים בין חיידקים. הקשר הסימביוטי הקיים בין חרקים המארח lignocellulose-משפיל החיידקים במעיים הוא הסביר, כמו גם שימושים תעשייתיים של חיידקים אלו ביומסה במפעל משפיל להפקת דלק ביולוגי.

חקירת הקהילה חיידקים במעי האחורי הטרמיטים - ראיון

ג'ארד לידבטר לוקח אותנו לטיול בטבע באמצעות מגוון של תושב החיים במעי האחורי טרמיטים - microenvironment ובו 250 זנים שונים למצוא בשום מקום אחר על פני כדור הארץ. ג'ארד מגלה כי סימביוזה הוצגו על ידי מערכת זו היא רב שכבתית והיא כרוכה לא רק היחסים בין טרמיטים ועל תושבי הבטן שלה, אלא גם כרוכה במסכת מורכבת של סימביוזה בין חיידקים במעיים עצמם.

שכבות של סימביוזה - לדמיין את במעי האחורי הטרמיטים קהילה מיקרוביאלית

אנו מציגים הליכי הוכחת כי ligands להיקשר הממברנה את פני השטח של תאית לעכל פרוטוזואה במעיים של טרמיטים Formosan תת קרקעי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כי ligands יחד עם פפטידים ממס להרוג אלה...

בדיקת פעילות של ליגנד Protozoacidal-ממוסס פפטידים נגד גוט הטרמיטים פרוטוזואה במבחנה (תרבות פרוטוזואה) ו In vivo (Microinjection לתוך טרמיטים במעי האחורי)

קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק.

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש<sup&gt; 13</sup&gt; C-גלוקוז

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט מביאים את המגוון המיקרוביאלי שנמצא בטבע למעבדה כדי להקל על מחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans. מובאים כאן פרוטוקולים להקמת ניסויי מיקרוקוסמוס, כאשר הניסויים מדגימים את היכולת לווסת את המגוון המיקרוביאלי הסביבתי כדי לחקור את הקשרים בין המגוון המיקרוביאלי הסביבתי לבין הרכב המיקרוביום של מעי התולעים.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

אנו מציעים פרוטוקול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אופטימלי להדמיית דגימות הטרוגניות ועדינות ביותר המכילות ביומסה צמחית ופטרייתית, יחד עם מיקרוביוטה וביופילם. פרוטוקול זה מאפשר לתאר את הממדים המרחביים של ארגון המיקרוביוטה.

מיקרוביוטה של גני נמלים אטיין: הדמיה של נוף מיקרוביאלי על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

חקור חילוץ DNA מחיידקי מעי הטרמיט Zootermopsis angusticollis ויזואליזציה של קהילת המיקרובים הגוטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מסלולי מטבוליזם אנרגיה ואקולוגיה מיקרוביאלית.

חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

גלה סרטונים נוספים