Name: מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: למדו את שיטת SELEX לבחירת אפטמרים ספציפיים לחלבון עמילואיד β הקשור במחלת אלצהיימר. הפרוטוקול מדגים בחירה באמצעות שעתוק מבחנתי וסינון ממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG030709 מ-NIH / NIA ו 07-65798 מן המחלקה לבריאות הציבור בקליפורניה. אנו מכירים מרגרט מ Condron לסינתזה פפטיד וניתוח חומצת אמינו, ד&quot;ר אליזבת פ &#39;נויפלד לסיוע ותמיכה בשלבים הראשוניים של הפרויקט, ד&quot;ר צ&#39;י קונג ב חן למתן תמיכה ריאגנטים, וד&quot;ר אנדרו D . אלינגטון לדיונים מועילים.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
<li>Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the early detection of Alzheimer's disease.</a> Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).</li>
<li>Kawas, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Early Alzheimer's disease.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B2-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shifts+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%3A+the+emerging+role+of+oligomeric+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies.</a> J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+pre-fibrillar+protein+assemblies+in+Alzheimer%27s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders.</a> Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+specifically+interact+with+the+prion+protein+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP.</a> J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).</li>
<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

נקודת המוצא של התהליך Selex הוא סינתזה של ספריה oligonucleotide אקראי המכיל בדרך כלל 10 -10 12 15 רצפים. ב-DNA Selex, ספריה זו משמשת מיד לאחר בריכה ssDNA שנוצר, ואילו RNA Selex, הפגינו כאן, הספרייה ssDNA מומר הראשון בריכת RNA enzymatically ידי שעתוק חוץ גופית. ואז, Selex מבוצע iteratively לפיה כל מחזור כולל חשיפה המחייב של oligonucleotides ליעד המיועד, חלוקת קלסרים מ בלתי מחייב רצפים, ו elution של רצפי מחייב. בשנת מחזורים מאוחר יותר, stoichiometry יעד ו-RNA ו /...

<table><tbody><tr><td>א&amp;#946;40</td><td>מעבדה לביופולימרים של UCLA</td><td></td><td>אבקה ליאופיליזית</td></tr><tr><td>מיקרו-מאזניים אוטומטיים MX5 Automated-S</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות בנפח 1.6 מ"ל מצופות סיליקון</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 או C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-הקסהפטורו-2-פרופנול (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>יש להשתמש במ┄מגירה (מנדף) כימית.</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>ערבבו במערבל וורטקס (Vortex) עד שהתמיסה תהיה צלולה. יש להכין את ה-APS באופן רענן בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>ערבלו במערבל Vortex עד שהתמיסה תהיה צלולה. כסו את מבחנת ה-RuBpy בנייר אלומיניום כדי להגן על התגובה מאור סביבתי. יש להכין את ה-RuBpy באופן רענן בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות.</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; עמודי הסמכה (desalting columns)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות בנפח 0.6 מ"ל, מצופות סיליקון</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי Novex Tricine (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10 בארות; גודל מיני (8 ס"מ X 8 ס"מ); 25 &amp;#x03BC;נפח טעינה לכל באר; טווח הפרדה מ-5 kDa עד 40 kDa</td></tr><tr><td>קוובט קוורץ</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Beckman DU 640</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספריית ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>בהזמנה מיוחדת</td><td>הספריה תוכננה כך שתכיל 49 נוקלאוטידים אקראיים המוקפים בשני אזורים קבועים המכילים אתרי קישור למספרי (primers) ואתרי שיבוט: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; 5'-G TCC GTT CGG GAT CCT-3'&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>רקומביננטי &lt;מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM)&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; DNA Polymerase המסופקת עם 10&amp;#215; בופר PCR ומבחנה נפרדת של MgCl2 בריכוז 25 mM&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; עבור PCR שגרתי.</td></tr><tr><td>תערובת נוקלאוטידים ל-PCR, תמיסה בריכוז 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(10 mM לכל אחד מ-dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>פריימר קדמי</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>בהזמנה מיוחדת</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>פריימר הפוך</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>בהזמנה מיוחדת</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>מעגל תרמי</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לטיהור PCR מסוג QIAquick (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות סטריליות בנפח 1.6 מ"ל עם מכסים בעלי טבעות איטום (O-rings)</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; מערכת לייצור RNA בקנה מידה גדול&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>הערכה מכילה: 120 &amp;#x03BC;תערובת אנזימים (RNA polymerase, RNasin רקומביננטי)&amp;#174; מעכב ריבונוקלאז ופירופוספאטאז אנאורגני רקומביננטי); 240 &amp;#x03BC;5 בופר טרנסקריפציה; 100 &amp;#x03BC;100 mM מכל אחד מ-4 ה-rNTPs; 110 U RQ1 DNase נקי מ-RNase, 1 U/&amp;#x03BC;ל; 10 &amp;#x03BC;DNA בקרה ליניארי, 1 מ"ג/מ"ל; 1 מ"ל נתרן אצטט 3M (pH 5.2); 1.25 מ"ל מים נקיים מנוקלאזים</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-cytidine 5&amp;rsquo;-טריפוספט, 250 &amp;mu;Ci (9.25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>פעילות סגולית: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)</td></tr><tr><td>פנול:כלורופורם:איסואמיל אלכוהול רווי ציטראט (125:24:1, pH 4.7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט לביולוגיה מולקולרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; מיקרו-עמודות G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>הושג מ-Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>ממולא מראש ב-Sephadex&amp;#8482; G-50 בדרגת DNA, ששיווי משקלו בוצע מראש בבופר STE המכיל 0.15% Kathon כחומר קוטל ביולוגים (Biocide)</td></tr><tr><td>מונה סינצילציה שולחני מדגם Triathler</td><td>Hidex Oy, טורקו, פינלנד</td><td>מודל Triathler LSC: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; בופר דגימות TBE-Urea (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי 6% TBE-Urea, עובי 1.0 מ"מ, 10 בארות</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; בופר הרצה TBE (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>חומר להסרת זיהום רדיואקטיבי</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;מיקרוסקופה אלקטרונית חולטה (SEM)&gt;SureLock&lt;/em&gt; מיני-תא</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;SureLock&lt;/em&gt; מיני-תא</td></tr><tr><td>סרט אוטורדיוגרפיה</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>יש להשתמש בחשכה מוחלטת</td></tr><tr><td>סרט אוטורדיוגרפיה, Hyperfilm&amp;#8482; ECL (פליטה כימולומינסצנטית)</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>ניתן להשתמש תחת תאורה בטוחה אדומה.</td></tr><tr><td>דיסקי ממבנהה</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>אסטר צלולוז מעורב, הידרופילי, 0.22-&amp;#x03BC;ממברנות m-disc</td></tr><tr><td>בסיס תמיכה מזכוכית סינונית לבקבוק בנפח 125 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>צלחית פטרי</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול לביולוגיה מולקולרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase רקומביננטי</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;מערכת להעתקה הפוכה</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase רקומביננטי</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; צבע טעינה</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחר aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

מחלת אלצהיימר (AD) הוא פרוגרסיבי, תלויי גיל, הפרעת ניווניות עם קורס חתרני שהופכת presymptomatic האבחנה שלה קשה 1. אבחנה ברורה לספירה מושגת רק נתיחה שלאחר המוות, ובכך לבסס אבחנה presymptomatic, מוקדם של אלצהיימר הוא חיוני לפיתוח טיפולים יעילים לניהול 2,3. עמילואיד β-חלבון (Aβ) הוא מרכזי בהיווצרות לספירה. מסיסים, מכלולים Aβ oligomeric הם האמינו הבסיסית neurotoxicity להשפיע על תפקוד סינפטי ואיבוד נוירון לספירה 4,5. צורות שונות של מכלולים Aβ מסיסים תוארו, לעומת זאת, יחסי הגומלין שלהם רלוונטיות האטיולוגיה לספירה בפתוגנזה הם מורכבים ולא הבין היטב 6. כלים ספציפיים ההכרה המולקולרית עשויה לפתור את היחסים בין מכלולים Aβ ולאפשר זיהוי ואפיון של מכלולים אלה מוקדם במהלך המחלה לפני שהתסמינים מופיעים. הכרה מולקולרית בדרך כלל מסתמכת על נוגדנים. עם זאת, מעמד חלופי של כלי הכרה, aptamers מולקולרית, מציעה יתרונות חשובים ביחס נוגדנים 7,8. Aptamers הם oligonucleotides שנוצר על ידי בחירה ב-vitro: התפתחות שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9,10. Selex היא תהליך חוזר ונשנה זה, בדומה לאבולוציה הדרווינית, מאפשר בחירה, הגברה, העשרה, והנצחה של הנכס, למשל, נלהב, ספציפית, מחייב ליגנד (aptamers) או פעילות קטליטית (ribozymes ו DNAzymes). למרות הופעתה של aptamers ככלים בתחום הביוטכנולוגיה והרפואה המודרנית 11, הם כבר לא מנוצלים בתחום עמילואיד. RNA מעטים או aptamers ssDNA נבחרו נגד צורות שונות של חלבונים Prion (PRP) 12-16. Aptamer RNA שנוצר נגד PRP רקומביננטי שור הוצגה להכיר שור PRP-β 17, מסיסים, oligomeric, גיליון β-עשירים גרסה קונפורמציה של PRP באורך מלא שנוצר סיבי עמילואיד 18. Aptamers שנוצר באמצעות טפסים monomeric וכמה סיבי β 2-microglobulin (β 2 מ &#39;) נמצאו לאגד הסיבים של חלבונים מסוימים amyloidogenic אחרים מלבד β 2 מ&#39; הסיבים 19. Ylera et al. תיאר aptamers RNA שנבחר נגד משותקת monomeric Aβ40 20. באופן בלתי צפוי, aptamers אלה קשורים סיבי Aβ40. בסך הכל, הנתונים הללו מעלים שאלות חשובות. מדוע נבחר aptamers נגד חלבונים monomeric לזהות צורות פולימריות שלהם? יכול aptamers נגד צורות monomeric ו / או oligomeric של חלבונים amyloidogenic לקבל? כדי לענות על השאלות האלה, ניסינו לבחור aptamers עבור קוולנטית מיוצב oligomeric Aβ40 21 שנוצר באמצעות תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) 22,23. בדומה לממצאים קודמים 17,19,20, aptamers אלה הגיבו הסיבים של Aβ וכמה חלבונים אחרים amyloidogenic סביר הכרה עמילואיד משותף פוטנציאלי מבניים aptatope 21. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה Selex המשמשים לייצור של אלה aptamers 21.

Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על ידי<em&gt; חוץ גופית</em&gt; שיטות האבולוציה מבוסס על זיקה יעד ספציפי. Aptamers הם כלים לזיהוי מולקולרי עם יישומים טיפולית, אבחון, מחקר מגוונות. אנו מדגימים שיטות הבחירה של aptamers לחלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר.

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

מחלת אלצהיימר (AD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית, תלוית גיל, בעלת מהלך הדרגתי ונסתר, ההופך את האבחון הפרה-סימפטומטי שלה...

המטרה הכוללת של ניסויי הבחירה היא לבחור מולקולות RNA הנקשרות באופן ספציפי וחזק לחלבון מטרה ב-RNA Selects. דבר זה מושג על ידי שעתוק in vitro של RNA מספריית אוליגונוקלאוטידי DNA אקראיים, ולאחריו דגירה של מאגר ה-RNA המשותף עם חלבון המטרה. כשלב שני, נעשה שימוש בקישור למסנן (filter binding).שלב זה מפריד את מולקולות ה-RNA הקושרות למטרה ממאגר ה-RNA שאינו קשור. לאחר מכן, מולקולות ה-RNA הקושרות למטרה עוברות שעתוק הפוך ל-DNA, הגברה באמצעות PCR ושעתוק חוזר ל-RNA.מאגר RNA זה, המועשר כעת בחלק מה-abers הקושרים, משמש לקשירה למטרה במחזור הבחירה הבא. בדרך כלל, לאחר שמונה עד 20 מחזורים, נבחרים ומאופיינים אפטמרים בעלי זיקה גבוהה וספציפיות למטרה. שלום, אני gal bean מהמחלקה לנוירולוגיה ב-UCLA, היום, far rahimi.פוסט-דוקטור בכיר במעבדה שלי יעמדיר בפניכם תהליך הנקרא cellex. השתמשנו בתהליך זה במעבדה כדי לבחור נוגדים עבור אמילואיד בטא אוליגומרים. אז בואו נתחיל.לקריאה, הכל לפניכם. בניסוי נבחר זה, מוכנים רצועות חלבון יציבות, הומוגניות וללא צברים, העשויות מחלבון עמילואיד בטא A beta 40, תוך שימוש בפרוצדורת האיסוף כפי שפורט בפרוטוקול וידאו קודם של JoVE, עם שינויים המפורטים בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לאחר הקשירה הצולבת, נקו את תערובת הרצועות הקשורות באמצעות עמודי הסמכה של 5 ml.ראשית, הניחו את העמוד על מעמד כאשר מתחת לפתח היציאה של העמוד מונח כוס כימית. הסירו את הפקק העליון מהעמוד והסירו את פקק היציאה. הניחו לתמיפת האחסון לזרום דרך העמוד ולאסוף אותה לכוס הכימית.בשלב הבא, יש להש equilibration (שיווי משקל) של העמודה באמצעות חמישה נפחי מצע של שרף, במנות של 3 mL של ammonium acetate בריכוז 10 millimolar ו-pH 8.3. לאחר שיווי המשקל של העמודה, יש להעביר לעמודה מנה של 0.5 mL מתערובת ריאקציית ה-pickup. יש להמתין עד שתערובת החלבון תיספג בשרף ולהיפטר מהחומר שעבר דרך העמודה (flow through).הנח בכלי הביקר את מבחנת האיסוף הראשונה מתחת לפתח יציאת העמודה. הוסף 0.5 מיליליטר של בופר אצטט לעמודה ואסוף את פראקציית ה-0.5 מיליליטר הראשונה הזורמת החוצה. חזור על תהליך האלוציה עד לאיסוף של פראקציות של 8.5 מיליליטר במבחנות המתאימות.הדגימות מאופיינות באמצעות SDS page ובדיקת בליעה. יש לאחד את הפראקציות בעלות תכולת החלבון הגבוהה ביותר ולערבב בעדינות באמצעות פיפטה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. יש לשמור אליקוט של 10 µL לצורך אנליזת חומצות אמינו ולאחסן את השאר.בשלב הבא, הכינו את מאגר ה-RNA. התחילו בהגברה של ספריית ה-DNA הסינתטית החד-גדילית באמצעות PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. טהרו את תוצר ה-DNA המוגבר ואמתו את כמות ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 2%.בדרך כלל, הריכוז והתנובה של ה-DNA הם 160 פלוס או מינוס 10 ng/µL ב-50 µL לכל מבחנה. לאחר מכן, בצעו תעתוק in vitro של ה-DNA בנוכחות CTP רדיואקטיבי למשך הלילה, ולאחריו עיכול של תבנית ה-DNA המוגברת באמצעות DNase למשך ארבע שעות כדי להפיק מאגר RNA מסומן ב-P 32, כפי שפירוט בפרוטוקול הכתוב המצורף. למרות שהיצרן Promega ממליץ על אינקובציה של 15 דקות עם DNase, מצאנו בניסויים שלנו שאינקובציה של ארבע שעות מובילה להסרה מלאה של כל תבנית ה-DNA לאחר האינקובציה עם ה-DNase.הפיקו את ה-RNA על ידי הוספת נפח אחד של פניל כלורופורם רווי ציטראט ואלכוהול איזואמיל, ערבבו ב-vortex למשך כדקה וסובבו בצנטריפוגה ב-16,000 Gs למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את הפאזה המימית העליונה למבחנה נקייה. בעזרת מיקרו-פיפט, הוסיפו נפח אחד של כלורופורם אלכוהול איזואמיל, ערבבו ב-vortex למשך דקה וסובבו בצנטריפוגה. כפי שנעשה קודם לכן, הסירו את הפאזה התחתונה באמצעות שאיבה בעזרת מיקרו-פיפט.שימו לב שבשלב זה קל יותר להסיר את הפאזה התחתונה מאשר את העליונה. יש להשליך את הפאזה התחתונה לפסולת. לאחר מכן, כדי להשקיע את ה-RNA, הוסיפו 0.1 נפח שווה ערך של sodium acetate בריכוז three molar ונפח שווה ערך אחד של isopropanol.ערבב והנח במקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, סבב, שאב את העלייה (supernatant) ושטוף את משקע ה-RNA עם 0.5 מיליליטר של 70% ethanol; לאחר השטיפה באתנול, צנטריפוג ושלף את האתנול. ייבש את משקע ה-RNA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בבלוק חימום, המס את דגימת ה-RNA בבופר STE בריכוז 150 מילימולר pH 8.0 לנפח זהה לזה של תגובת ה-in vitro transcription.חממו את המבחנה המכילה את תוצר ה-RNA בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות בבלוק חימום ובצעו ערבוב ב-vortex. כדי להקל על המסת ה-RNA, צנטריפוגו במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר; שמרו 1 µL של RNA לצורך ספירת נצנוץ (scintillation counting) ואלקטרופורזה של ג'ל poly acrylamide urea TPE. לאחר המסת ה-RNA, הסירו נוקלאוטידים שלא נשלבו באמצעות עמודי G 50, בהתאם להוראות היצרן.זכרו לשמור מיקרוליטר אחד של ה-RNA המזוהה ב-G 50 עבור ספירת סינטילציה ואלקטרופורזה בג'ל דנטורציה. השתמשו בשתי מנות ה-RNA של מיקרוליטר אחת משלבי שיקוע ה-RNA וההסמכה ב-G 50 עבור ספירת הסינטילציה. חשבו את אחוז שילוב הסימון לאחר ספירת הסינטילציה, ולאחר חישוב אחוז השילוב, חשבו את תנובת ה-RNA ואת הפעילות הסגולית של ה-RNA.לבסוף, בחן את ה-RNA לפני ואחרי טיהור ב-G 50 על ידי הרצת הדגימות על ג'ל פולי-אקרילאמיד 6%TBE urea וויזואליזציה של ה-RNA באמצעות אוטורדיוגרפיה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. אם איכות המוצר המסומן מספקת, המשך לערבב את ספריית ה-RNA עם דגימת החלבון לצורך סלקציות. דגור את מלאי ה-RNA ב-90 °C למשך 10 דקות לצורך דנטורציה ולאחר מכן בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לצורך רנטורציה איטית.בזמן דגירת ה-RNA, המיסו מבחנה אחת של חלבון ב-8 µL של sodium hydroxide בריכוז 60 mM ובתוספת של 36 µL של מים דה-יוניים ללא גרעינים. בצעו סוניקציה לתערובת למשך דקה אחת והוסיפו 36 µL של RNA binding buffer בריכוז 2X. עבור הביקורת השלילית.ערבבו RNA עם 20 µL של 10 X RNA binding buffer והשלימו את הנפח ל-200 µL על ידי הוספת nuclease free water. עבור תגובת הקישור, ערבבו 20 µL מתערובת החלבון וה-RNA עם 20 µL של 10 X RNA binding buffer והשלימו את הנפח ל-200 µL עם nuclease free water.דגרו את המבחנות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר; בזמן דגירת הדגימות, הכינו את המסננים ואת מערך קישור המסננים. ראשית, חברו בקבוק עם פיית צד בנפח 125 milliliter לכניסת הוואקום. הניחו תמיכת זכוכית נקבובית שנוקתה מראש עבור המסנן על הבקבוק עם פיית הצד.בשלב הבא, יש להשרות שלוש ממברנות סינון בשני עד שלושה מיליליטר של 1X RNA binding buffer בתוך צלחת פטרי של 35 על 10 מילימטר למשך 10 עד 15 דקות. כאשר דגימות הביקורת השלילית ותגובת הקישור סיימו את האינקובציה, סבב אותן בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הפעל את הוואקום והנח את הממברנה הראשונה על הזכוכית נקבובית; בעזרת מיקרופיפט, טפטף 0.5 מיליליטר של RNA binding buffer על הממברנה.כווננו את הוואקום כדי לאפשר זרימה איטית של כל טיפת בופר דרך הממברנה. מסנן ראשון זה משמש אך ורק לכיוון של יניקת הוואקום. לאחר מכן, הניחו את הממברנה השנייה על הזכוכית נקבובית ובשימוש באותה קצב זרימה, יישמו את הבקרת השלילה על הממברנה.לאחר יישום הדגימה, שטפו אותה ארבע פעמים עם מנות של 0.5 milliliter של RNA binding buffer בריכוז one X. הסירו את ממברנת הביקורת השלילית והניחו אותה בתוך מבחנה לספירת סינטילציה. החליפו את הזכוכית הנקבובית בתמיכת זכוכית נקבובית שנייה שעברה ניקוי מוקדם.הניחו את הדיסקה השלישית על הזכוכית הנקבובית והוסיפו את תערובת תגובת הקישור. שטפו את המסנן כפי שהודגם כעת; ניתן להגדיל את מספר השטיפות במחזורי הבחירה המאוחרים יותר. כדי להגביר את רמת המחומקות (stringency) של תנאי הבחירה, הוציאו את דיסקת המסנן והניחו אותה בתוך מבחנה בנפח 1.6 milliliter המסומנת כ"תגובת קישור".בצע ספירת סינטיגציה עבור שני המסננים. חשב את רמת הרדיואקטיביות שנקשרה למסנן בהשוואה לכמות הרדיואקטיביות הכוללת שהועברה לממברנות. נתון זה מספק אינדיקציה להעשרה של הקישור ככל שהסלקציה מתקדמת.לאחר ספירה במונה סינטיגציה, הוצא את מסנן תגובת הקישור מהמבחנה והנח אותו בצלחת פטרי נקייה ויבשה בגודל 35 על 10 מילימטר. באמצעות סקלפל נקי ופינצטה, גזור את הממברנה לחתיכות קטנות. השתמש בפינצטה כדי להעביר את החתיכות הגזורות חזרה לבקבוק הסינטיגציה.הוסף 400 µL של בופר אלוציה והדגר את המבחנה בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 דקות. בתום 10 דקות, ערבב באמצעות וורטקס, צנטריפוג את המבחנה במהירות מרבית בטמפרטורת החדר, שאב ואסוף את בופר המיצוי למבחנה חדשה ומסומנת. מדוד את ספירות הרדיואקטיביות שנותרו במבחנה המכילה את חלקי הממברנה באמצעות ספירת סינטיגציה. כדי להעריך את יעילות המיצוי, חזור על פעולת המיצוי שלוש פעמים; היעילות לאחר שלוש מיצויים היא בדרך כלל כ-95% עד 96%. לאחר מכן, הוסף 3 עד 4 µL של גליקוגן כקו-משקיע של RNA, ומצע וחשקי את ה-RNA ששוחרר מהפילטר כפי שהודגם בעבר, למעט העברה למקפיא של 20- °C למשך הלילה.לאחר דגירה של לילה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה; ה-RNA ישקע לשלב נוזלי שבקושי נראה לעין. שאב את הנוזל העליון בזהירות, מבלי להזיז את שלב המשקע שבקושי נראה בתחתית המבחנה. שטוף את משקע ה-RNA באמצעות 0.5 milliliters של 70% ethanol, סבב בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות מרבית בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, והסר את ה-ethanol על ידי שאיבה, מבלי להזיז את שלב המשקע שבקושי נראה לעין.המס את משקע ה-RNA ב-50 µL של STE buffer והמשך לניקוי ב-G 50 כפי שמתואר עבור ה-RNA שהתעתק זה עתה בפרוטוקול הכתוב המצורף. כדי להמשיך למחזור הבחירה הבא, בצע תעתוק הפוך של ה-RNA ל-DNA ולאחר מכן הגברה ב-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. זכור לכלול דגימת ביקורת שלילית ללא reverse transcriptase.בדקו את תוצרי ה-PCR על ג'ל כדי לוודא שנתיב הביקורת השלילית ריק והנתיבים האחרים הם כמצופה. המשיכו לשלב התעתוק והסימון של ה-RNA כפי שהודגם קודם לכן לצורך שימוש. במחזור הבא בחרו את האוליגומר שנוצר.חלבון beta 40 ששימש כאן לצורך סלקציות טוהרה כפי שמוצג בפרוטוקול וידאו זה, ולאחר מכן נבחן באמצעות מדידות בליעה המוצגות על ידי העקום האדום ו-SDS page. החלבון יוצא בעקביות מהעמודה בשברים שלושה עד חמישה, וחומר הקישור הצולב יוצא לאחר שבר שישה, כפי שמעידה העלייה בבליעה בשבר שבעה. ה-SDS page מראה את התפלגות האוליגומרים הטיפוסית של a beta 40.שלמות ה-RNA עבור כל מחזור בחירה (select cycle) היא חשובה להתקדמות איטרטיבית של הבחירות. לאחר תמלול וסימון של ה-RNA, נבדקת איכות ה-RNA המסומן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה. להלן פרופיל טיפוסי של תוצר RNA מסומן ושלם לפני ואחרי טיהור ב-G 50; תבנית DNA מזוהמת ממחזורי בחירה קודמים שעדיין נוכחת לאחר תגובת התמלול in vitro עלולה להפחית את יעילות הבחירה ולדרוש מחזורים נוספים.אלקטרופורזה של תגובת השעתוק ההפוך ולאחריה הגברה באמצעות PCR מראה את תוצר ה-DNA הצפוי; היעדר תוצר DNA במבחנות של בקרת השלילה מעיד על הסרה מוצלחת של תבנית ה-DNA על ידי טיפול ב-DNase לאחר שעתוק in vitro. אוקיי, הרגע הראינו לכם כיצד לבחור נוגדים עבור אוליגומרים של amyloid beta 40 המקובעים קוולנטית באמצעות קשירה צולבת פוטו-כימית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שלשני המולקולות חייב להיות מבנה יציב כדי שתהיה להן זיקה גבוהה, ולזכור שלשניהם יש מבנה תלת-ממדי שבו הם מקיימים אינטראקציה.זהו, סיימנו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

selection-aptamers-for-amyloid-protein-causative-agent-alzheimer-s

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים.  הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

כדי לחקור את ההשפעות של Aβo in vivo, פיתחנו מודל המבוסס על עירויים חוזרים ונשנים של Aβo מסיס בהיפוקמפוס יחד עם עירוי רציף של נוגדן Aβo (6E10) בהיפוקמפוס באמצעות משאבות אוסמוטיות כדי לנטרל את ההשפעה הנוירוטוקסית של Aβo.

מוחיים במודל חיה של עמילואיד-ביתא כרונית oligomer העירוי נוטרלה על ידי נוגדן טיפול חדורי משאבות אוסמוטי

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר ומשווה את ההליך לביצוע ניתוח של אזור מלא או תת-אזור עניין של מקטעי מוח של עכברי sagittal כדי לכמת את עומס העמילואיד-בטא במודל העכבר המהונדס APP/PS1 של מחלת אלצהיימר.

כימות מלא לעומת תת-אזורי של עומס עמילואיד-בטא על מקטעי מוח של עכבר

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למדו את שיטת SELEX לבחירת אפטמרים ספציפיים לחלבון עמילואיד β הקשור במחלת אלצהיימר. הפרוטוקול מדגים בחירה באמצעות שעתוק מבחנתי וסינון ממברנה.

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

גלה סרטונים נוספים