התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte
19 במאי 2010
אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר מבשרי אוליגודנדרוציטים מתאי גזע עובריים באמצעות סדרה של שלבי תרבית במשך 30 יום. זה מושג על ידי יצירת גופי עובר מתאי ES של עכבר כדי ליזום התמיינות תאים. כשלב שני, גופי העוברים מטופלים במולקולות קטנות, חומצה רטינואית ומורפיום טהור, הגורמים להתמיינות מכוונת של התאים למאורת ליגה.
קודמני ציט. כשלב שלישי, גופי העובר מתפרקים לתאים בודדים לאחר 22 ימים נוספים. בתרבית, כ-80% מהתאים הם OPCs.
לאחר מכן, ה-OPCs הנגזרים מ-MESC מומרים עם נגיפי bao הנושאים תת-יחידה של NAV 1.2 על מנת ליצור תוצאות OPCs מזנקות המתקבלות המראות את הביטוי של סמן OPC ותכונות הזינוק של OBCs שמקורם ב-MESC בהתבסס על מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ורישומים אלקטרופיזיולוגיים. היי, אני פונג צ'יאנג מהמעבדה של ד"ר אינג במחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. אנו קשורים גם לבית החולים שרינרס לילדים בצפון קליפורניה.
היי, אני ויאל ראג', גם הוא ממעבדת דנג. היום נראה לכם נוהל להתמיינות של תאי גזע של עכברים לתאי מבשר רצח עם. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התכונות של תאי גזע עובריים דרד אוליגודנדרוציטים על מנת ליצור תאים בעלי פוטנציאל טיפולי טוב יותר.
אז בואו נתחיל. כיום, תאי מבשר אוליגודנדרוציטים או OPCs ייווצרו מקו תאי גזע עובריים של עכבר OG 2 GFP. תאי גזע עובריים אלה צריכים לעבור כל שלושה ימים כדי לשמור על בריאותם בצפיפות אופטימלית ולמנוע התמיינות ספונטנית. מעבר.
תאי ה-ESS כשהם נמצאים במפגש של 70% מתחת למכסה זרימה למינרית. הסר את המדיום מעל התרבות. יש לשטוף עם PBS ועיני טריפסין עם שני מיליליטר של חימום מראש.
נסיעה אחת של LE אקספרס לחמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה והשהה מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של מדיום תאי MES. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וגלו אותם ב-1000 RP למשך חמש דקות.
השעיה בצלחת בינונית MESL, עשירית מהתאים על שכבה משולבת של מזיני מת' מוקרנים במדיום תאי MES. לאחר שלושה ימים תאי ES הם כ-70% מתכנסים ומוכנים למעבר או השעיה ליצירת גופי עובר כדי לגרום לגופי עובר ולהתחיל להתמיין מושבות תאי ES של עכברי טריפסין כמו קודם ואז להשעות מחדש את התאים בהחלפת סרום נוקאאוט או מדיום KSR. ספרו את התאים ב-HEMO TER, דללו את התרחיף ב-KSR.
בינוני עד 15,000 תאים לצלחת מיליליטר שלושה מיליליטר לכל באר של תרבית צלחת שש בארות חיבור אולטרה-נמוך. התאים התלויים ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. החלף את המדיום לחלוטין כל יומיים.
החל מהיום הרביעי, החלף את המדיום היומי ביום הרביעי השלם את ה-KSR עם 0.2 חומצה רטינואית מיקרו-מולרית ביום החמישי תוסף גם חומצה רטינואית וגם רעב ראשוני מיקרו-מולרי אחד ביום השישי והשביעי. האכילו את גופי העובר בשני מדיומים, בתוספת 0.2 חומצה רטינואית מיקרומולרית ורעב ראשוני מיקרומולרי אחד. לאחר שמונה ימים בתרבית, רוב גופי העוברים מבטאים GFP ומוכנים להיות עיני טריפסין מפוזרות ולספור את התאים כמו קודם.
ואז להחיות אותם ב-3.5 כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר. במדיום OPC שלושה מיליליטר של התרחיף במדיום OPC. באמצעות שימוש בכלים מצופים פולי אורניתין 60 מילימטר בערך כל שבוע, התאים יהפכו למתכנסים וייראו כמו המעבר הזה לתאים כמו קודם עם טריפסין של שלוש דקות.
30 יום לאחר השעיית ה-resus המקורית. במדיום KSR, התאים מראים מאפיינים של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים ליצירת OPCs מזנקים. השתמש ב-OPCs שמקורם ב-ESL של עכבר שהם בין 50 ל-70% מתלכדים.
החלף את המדיום ב-XPBS אחד כדי לשטוף את התאים. כדי להכניס נתרן מגודר מתח. יחידת משנה אלפא של ערוץ 1.2.
אנו משתמשים בערכת תעלות הנתרן האחורית של MAM. מערבבים מיליליטר אחד של רכיב MAM אחורי A עם ארבעה מיליליטר של XPBS אחד. הסר את שטיפת ה- PBS והוסף את הרכיב המדולל.
דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. החלף את סוכן הזיכרון האחורי במדיום OPC משופר ברכיבים B ו-C כמתואר בערכה. ההוראות מדגרות לשעתיים נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, החלף את המדיום המשופר במדיום OPC טרי. לאחר 24 שעות נוספות של תרבית, ניתן לבחון את ה-OPCs הנגזרים מ-ESL לזינוק בנקודת זמן זו. ה-EBS אינו מראה שום פלואורסצנטיות GFP.
ה-EBS מראים ביטוי GFP חזק ומוכנים לתרבית פירוק במשך כ-30 יום לאחר תרחיף ה-resus המקורי. במדיום KSR, רוב התאים חיוביים למערכת החיסון לצביעה של NG 2, מה שעולה בקנה אחד עם ביטוי GFP. עם זאת, בניגוד ל-OPCs במוח, OPCs אלה שמקורם בתאי MES אינם מצליחים לירות פוטנציאל פעולה גם כאשר התאים היו דה-פולריזציה לאפס מילי-וולט.
לאחר הצגת תת-יחידת NAV 1.2 על ידי התמרה ויראלית, OPCs אלה שמקורם בתאי MES מתרגשים ויורים פוטנציאל פעולה. זה עתה הראינו לכם כיצד להבדיל תאי גזע עובריים של עכברים ל-OPCs וליצור OPCs מזנקים על ידי התמרה ויראלית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאחסן את חומצת הרטינואיד לכל מורפיום ו-FGF שניים כראוי ולהשתמש תמיד בחומרים טריים, להשליך כל חומצה רטינואידית נוספת לאחר השימוש.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להגזירה של תאי גזע עובריים של עכבר לתאי מקור של אוליגודנדרוციטים (OPCs) באמצעות מולקולות קטנות. השיטה משיגה יעילות גבוהה ביצירת OPCs מסוג +Olig2+NG2 בתוך 30 ימים, וכוללת טכניקה להפקת OPCs "ספייקינג" (spiking) המסוגלים להפיק פוטנציאלי פעולה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
רקע
- תאי מוצא של אוליגודנדרוציטים (OPCs) חיוניים למיאלינציה במערכת העצבים המרכזית.
- ניתן לגזור תאי גזע עובריים של עכבר (ES cells) לתאי OPCs למטרות מחקר וטיפול.
- מולקולות קטנות יכולות להכווין את תהליך הגזירה ביעילות.
- הבנת תכונות ה-OPC יכולה להגביר את הפוטנציאל הטיפולי בהפרעות נוירולוגיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להפקת OPCs מתאי ES של עכבר.
- בדיקת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של OPCs מבדלים.
- בחינת הפוטנציאל של OPCs בעלי פעילות חשמלית (spiking) עבור יישומים טיפוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גופים עובריים נוצרים מתאי ES של עכבר כדי להתחיל את תהליך הדיפרנציאציה.
- מולקולות קטנות, כולל רטינואיק אסיד ומורפין טהור, משמשות להשראת דיפרנציאציה.
- התאים מופרדים ומגודלים כדי להעשיר את אוכלוסיית ה-OPCs.
- טרנסדוקציה ויראלית משמשת להחדרת תעלות נתרן תלויות-מתח לתוך OPCs.
תוצאות עיקריות
- כ-80% מהתאים המטופחים מזוהים כ-OPCs לאחר 30 ימים.
- מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה מאשרת את הביטוי של סממני OPC.
- רישומי אלקטרופיזיולוגיים מדגימים את תכונות הפעימה (spiking properties) של OPCs שעברו טרנסדוקציה.
- OPCs שלא עברו טרנסדוקציה אינם מראים פוטנציאלי פעולה, דבר המדגיש את יעילות שיטת הטרנסדוקציה הוויראלית.
מסקנות
- הפרוטוקול מייצר ביעילות OPCs מתאי גזע עובריים של עכבר.
- טרנסדוקציה ויראלית ממירה בהצלחה OPCs לתאים בעלי פוטנציאל פעולה (spiking cells).
- שיטה זו מספקת תשתית לחקר OPCs בהקשר של מחקר וטיפול נוירולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גבייה יעילה של תאי גזע עובריים לתאי אב של אוליגודנדרוციטים (OPCs) נותנת מענה לצורך קריטי במקורות תאים הניתנים להרחבה ומחויבים לשושלת תאיות במחקרי רגנרציה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). פרוטוקול זה מאפשר ייצור בתפוקה גבוהה של OPCs המוגדרים פנוטיפית, ובכך תומך ברמת ביטחון חזויה בשלבי תיקוף מוקדמים של מטרות ובמחקרים פונקציונליים. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובמיון תיקי פיתוח עבור אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאים המכוונות למחלות דמיליניזציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מחויבות לשושלת אוליגודנדרוגלית וספציפיות של מסלולים באמצעות סממנים מולקולריים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי יצירת OPCs עם פרופילי ביטוי עקביים של Olig2 ו-NG2.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי באישור של מטרות פונקציונליות באמצעות אפיון אלקטרופיזיולוגי של תתי-אוכלוסיות של OPCs.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מקור הדיר במצב שחזור של OPCs מאושרים עבור סריקת תרכובות ובדיקות פנוטיפיות המשך.
- מסטנדרט את תוצרי הדיפרנציאציה, ובכך מבטיח פיתוח בדיקות כמותי וניתן להרחבה.
- מאפשר הערכה מהימנה של מולקולות מועמדות במערכות של שושלת אוליגודנדרוציטים הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרנת מודלים של OPC in vitro עם פנוטיפים שמקורם ברקמה ראשונית לצורך המשכיות תרגומית.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אפשור מחקרים פונקציונליים על OPCs מסוג spiking ו-nonspiking.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנונית עבור מועמדים בקו הייצור של טיפול תאי המכוונים לדמיאלינציה.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר תיקוף מוקדם של מטרות, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי על ביולוגיה של OPC.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי התחייבות שושלת ותכונות תפקודיות של OPC.
- סינון (Screening): מספק אוכלוסיות OPC סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור פלטפורמות של בדיקות כמותיות.
- אנליטיקה: מספק תוצרי אימונופלואורסצנציה ותוצרי אלקטרופיזיולוגיה לצורך ניתוח השוואתי של תתי-סוגים של OPC.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro לבין מודלים של רקמה ראשונית לצורך התאמה פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר ליצירת OPCs במספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים המתמקדים ב-OPC.
- ערך תפעולי: מספק ייצור סטנדרטי, ניתן להרחבה וניתן לשחזור של OPC עבור תהליכי עבודה בין-צוותיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתיקי פיתוח של תרפיה תאית ונוירו-רגנרציה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של מועמדים לטיפולים מבוססי OPC.
שיקולים ליישום
- דורש מיומנות בתרביות של תאי גזע, דיפרנציאציה וטכניקות של טרנסדוקציה ויראלית.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה ותשתית להקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי דיפרנציאציה ובדיקה בין צוותים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור קווי תאי גזע עובריים שונים או מודלים ספציפיים למין.
- תלוי באיכות עקבית של הריאגנטים ובתזמון מדויק של שלבי הדיפרנציאציה.
