Name: התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למדו פרוטוקול להפקת תאי מבשר אוליגודנדרוציטים מתאי גזע עובריים של עכברים תוך 30 יום. השיטה משתמשת במולקולות קטנות ומייצרת OPCs יעילים לחקר מיאלינציה וטיפול במחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו הייתה חלק נתמך על ידי מענקים ל WD מן המכונים הלאומיים לבריאות (RO1 NS059043 ו RO1 ES015988), טרשת נפוצה האגודה הלאומית, רוש קרן מחקר אנמיה, פלדשטיין רפואי הקרן, ואת שריינרים חולים לילדים. ברצוננו להודות לד&quot;ר תענוג דוד מטוס ג&#39;ניפר לקבלת הצעות. אנו מצהירים שום אינטרסים מתחרים הקשורים במאמר זה.

נהלים מפורטים של יצירת תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) מ-GFP Olig2 בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר קו ES תא GFP-Olig2 (G-Olig2), הוא רכש מן האוסף התרבות האמריקאית סוג (ATCC). MESCs הם passaged שגרתי כל 3 ימים על העכבר מוקרן עובריים שכבת פיברובלסטים מזין (MEF). התאים הם MEF מצופה לתוך הג'לטין 0.1% מצופי שש היטב בתרבות רקמה צלחת לפחות יום אחד לפני passaging ESCs. בינוני תרבות המסקלין הוא מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) (GIBCO) בתוספת 20% עוברי שור בסרום (GIBCO), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 נתרן pyruvate מ"מ, 0.1 β-mercaptoethanol /, mM חומצות 1% אמינו חיוניות ( NEAA), ו - 1000 U / ml מעכבות גורם ללוקמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות MES הם trypsinized (TrypLE, 5 דקות, 37 ° C) לתאים בודדים המרחפים בנוקאאוט בסרום בינוני (KSR) תחליף, אז התאים מועברים מצורף שחקן המשנה Ultra-Low שש היטב צלחת (קורנינג) בכל תא צפיפות של 50,000 תאים / 2 ס"מ. בתנאים אלה, mESCs טופס גופים embryoid (EBS). KSR בינוני מורכב, בינוני מינימלי חיוני (-ממ) בתוספת KSR 20%, 1 נתרן pyruvate מ"מ, NEAA 1%, ו - 0.1 mM β-mercaptoethanol /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאותו יום 4 יום 7, חומצה רטינואית (RA, 0.2 מ ') ו purmorphamine (פור, 1 מ') כלולים כפי שמוצג באיור. 1A ב KSR N2 או בינוני. המדיום הוא N2-ממ המכיל תוספת 1X N2, נתרן 1 mM pyruvate, NEAA 1%, ו - 0.1 mM β-mercaptoethanol /. המדיום משתנה כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום 8, EBS הם disaggregated באמצעות TrypLE (5min, 37 ° C) מצופה על polyornithine מצופה מנות 0.01% במדיום OPC שמורכבת בינוני N2 ו פיברובלסטים גורם הגדילה-2 (FGF-2, 20 ng / ml). המדיום משתנה כל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים trypsinized (TrypLE, 3 דקות, 37 ° C) replated בערך כל שבוע כאשר הם הופכים ומחוברות. באותו יום 30, מעל 80% מהתאים מראים GFP/Olig2 הביטוי הם NG2 חיובי, האופיינית OPCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור OPCs spiking, Na + BacMam ערוץ ערכת משמש להציג Na v 1.2 למקטע לתוך אלה המסקלין הנגזרות OPCs. מגיב BacMam (1, מרכיב מ"ל) מעורבב עם PBS לנפח סופי של 5 מ"ל. לאחר מכן, מגיב BacMam מעורבת מתווסף לתוך התרבות OPCs המסקלין הנגזרות בצלחת תרבות 60 מ"מ (בנקודת המפגש 50-70%) לפני השטיפה עם PBS. לאחר דגירה 2 שעות, מגיב BacMam מעורבת מוסר והוחלפו בינוני OPC בתוספת משפר 1X. משפר הוא B מרכיב מחדש ב DMSO (רכיב C). בשלב הבא, לאחר דגירה של 2 שעות נוספות עם המדיום משפר מוסר והוחלפו בינוני OPC להשלים. התאים assayed 24 שעות מאוחר יותר. </li></ol> נציג תוצאות: בעקבות פרוטוקול בידול באיור. 1A, G-Olig2 mESCs הושעו תחילה בינוני KSR ובמשך 4 ימים כדי ליצור גופים embryoid (EBS) (איור 1B). לאחר מכן, אנו ברצף התייחסו EBS עם RA ו - פור. EBS לא הראה שום הקרינה ב-GFP יום 4 והביע הקרינה GFP חזק D8 (איור 1B). בנקודה זו בזמן, EBS היו trypsinized ו מצופה במדיום N2 בתוספת גורמי גדילה FGF-2. אחרי תרבות נוספת במשך 22 ימים (D30), אחוז תאים + GFP הגיעו 80.3 ± 0.6% על פי cytometry זרימת התוצאות שלנו. כפי שמוצג באיור. 1C, GFP + תאים חפפו עם מכתים NG2 בעקביות (96.4 ± 1.3% של תאים GFP חיובית היו NG2 חיובית, 94.8 ± 1.5% NG2 תאים חיובי GFP היו חיוביים). לכן, תאים אלה מבטאים GFP/Olig2 ו NG2, הגדרת אותם OPCs. המסקלין הנגזרות OPCs (76 תאים), לא הצליחו לירות פוטנציאל פעולה על שלילת קוטביות (איור 2 א). לאחר transducing עם baculovirus נושאת את Na v 1.2 למקטע, המסקלין הנגזרות הללו OPCs (94.1%, 16 מתוך 17 תאים) יכולה להיות מסווגת spiking (איור 2B). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דיפרנציאציה של GOlig-המסקלין לתוך OPCs. (א) תוכנית המציגה את הפרוטוקול של הגוף embryoid (EB) מבוססי מולקולה קטנה מונחה בידול. בשעה D8, EBS היו disaggregated ו מצופה. התאים היו passaged פעם בשבוע כאשר הם הפכו ומחוברות. (ב) D8, אך לא D4 EBS, הראתה ביטוי של GFP. (ג) Immunostaining של NG2 (אדום) עולה בקנה אחד עם ה-GFP (ירוק) ביטוי ב D30. DAPI (כחול) היה בשימוש כדי לזהות את הגרעינים. בר קנה מידה: 20 מ"מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דור OPCs spiking מ nonspiking המסקלין הנגזרות OPCs ידי וירוס בתיווך Na v ביטוי הערוץ. (א) פוטנציאל הממברנה נערך -60 mV ו המסקלין הנגזרות OPCs נכשל אש הפוטנציאלים לפעולה, גם כאשר התא היה depolarized ל 0 mV. (ב) דוגמה המסקלין הנגזרות OPCיורים פוטנציאל פעולה (מסומן באדום) לאחר התמרה ויראלית.

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לתאי גזע עובריים (ESCs), שבודד עובר הבלסטוציסט, יכולים להתמיין לכל שושלות תאים של האורגניזם 3, 4, מתן במערכת מודל במבחנה לחקר יונקים התפתחות מוקדם, כולל מפרט oligodendrocyte. mESCs הוכחו להתמיין לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs) עם טיפול של קיפוד קולי (ששש) 5. יתר על כן, בידול ששש-Induced OPC מ mESCs שומרת לעצמה את העיתוי הנכון שנצפתה ההתפתחות העוברית 6. לפיכך, אופי של בידול OPC במבחנה מן mESCs נחשב בקנה אחד עם מה שנלמד מן בפיתוח vivo. הנה, באמצעות מולקולות קטנות RA ואת פור אגוניסט ששש, אנחנו הבדיל בהצלחה את ה-G-Olig2 mESCs לתוך ה-GFP Olig2 + + + NG2 OPCs עם יעילות גבוהה. OPCs, המאופיינת הביטוי של proteoglycan NG2 7 ו הגורם הסליל לולאה, סליל שעתוק Olig2 8, ליצור oligodendrocytes ב CNS בפיתוח בוגרת, שם הם מהווים אחוז משמעותי (~ 5%) של תאים הכולל הן סוג התא העיקרי מתרבים 9. במשך כמעט שני עשורים חוקרים הוכיחו Na ערוצי V באים לידי ביטוי subpopulation של OPCs והוא יכול להיות מופעל על שלילת קוטביות 10, 11. יתר על כן, תצפית מרשימה האחרונות 9 היה כי ב CNS עכברוש באתרו החומר הלבן, OPCs (~ 50%) שנוצר פוטנציאל פעולה כאשר depolarized בהתאם הביטוי של נתרן מתח מגודרת (Na V) ערוצים, ולכן יכול להיות מחולק spiking ו nonspiking subpopulations. עם זאת, את הפונקציות של מאפיינים אלה spiking עדיין אינו ידוע ברובו. מצאנו כי, electrophysiologically, המסקלין הנגזרות OPCs הבדיל עם פרוטוקול ששש תלויים, לא היה זהה ב OPCs המוח באתרה. לאחר החדרת למקטע Na V 1.2, אלה שקט המסקלין הנגזרות OPCs היו מסוגלים spiking. לפיכך, spiking / nonspiking המסקלין הנגזרות OPCs ופרוטוקול בידול המתוארת כאן עשויה להקל (1) ללמוד את ההבדלים בין תפקודי spiking ו nonspiking OPCs, (2) גורמים ההקרנה חדש שיכול לקדם ערוץ ביטוי נתרן המסקלין הנגזרות OPCs, ( 3) פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול בידול של OPCs מן האדם ESC או גזע המושרה pluripotent תאים (iPSCs).

<table><tbody><tr><td>פיברובלסטים של עיכורים עובריים של עכברים (MEFs)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>פורמורפמין (Purmorphamine)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי oligodendrocyte

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes הם תאים myelinating של מערכת העצבים המרכזית. עבור טיפול בתא משובי במחלות demyelinating, יש עניין משמעותי הנובע אוכלוסייה טהורה של השושלת, מחויב תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) להשתלה. OPCs מאופיינות בפעילות של Olig2 גורם שעתוק וביטוי פני השטח של NG2 proteoglycan. בעזרת ה-GFP-Olig2 (G-Olig2) עכבר תא גזע עובריים (המסקלין) קו עיתונאי, אנו אופטימיזציה התנאים בידול של mESCs לתוך ה-GFP Olig2 + + + NG2 OPCs. בפרוטוקול שלנו, אנחנו הראשונים לתאר את הדור של גופים embryoid (EBS) מ mESCs. שנית, אנו מתארים את הטיפול המסקלין הנגזרות EBS עם מולקולות קטנות: (1) חומצה רטינואית (RA) ו - (2) קיפוד קולי (ששש) purmorphamine אגוניסט (פור) בתנאים מוגדרים תרבות לכוון בידול EB לתוך השושלת oligodendroglial. לפי גישה זו, OPCs ניתן להשיג עם יעילות גבוהה (&gt; 80%) בפרק זמן של 30 ימים. תאים שמקורם mESCs בפרוטוקול זה דומים phenotypically כדי OPCs שמקורם בתרבית רקמה ראשונית. המסקלין הנגזרות OPCs לא להראות את הנכס spiking תיאר subpopulation של OPCs המוח באתרם. כדי לחקור את הנכס הזה אלקטרו, אנו מתארים את הדור של spiking המסקלין הנגזרות OPCs ידי ectopically להביע Na<sub&gt; V</sub&gt; 1.2 למקטע. Spiking ו nonspiking התאים המתקבלים פרוטוקול זה יעזור מחקרים פונקציונלי מראש על שני subpopulations של OPCs.

אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת &quot;מתחזקים&quot; בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

אוליגודנדרוציטים הם התאים המיאליניזריים של מערכת העצבים המרכזית. עבור טיפול תאי רגנרטיבי במחלות דמיאליניזציה, קיים צורך משמעותי ב...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק תאי קדם-אוליגודנדרוציטים מתאי גזע עובריים באמצעות סדרה של שלבי תרבית לאורך 30 יום. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת גופי עובריים (embryo bodies) מתאי ES של עכבר כדי להתחיל את התמיינות התאים. כשלב שני, גופי העובריים מטופלים במולקולות קטנות, רטינואיד (retinoic acid) ומורפין טהור, המשרים התמיינות מכוונת של התאים לתאי קדם-אוליגודנדרוציטים.תאי קדם-Cyte. כשלב שלישי, גופי העובר מופרדים לתאים בודדים לאחר 22 ימים נוספים. בתרבית, כ-80% מהתאים הם OPCs.בשלב הבא, תאי OPC המופקים מ-MESC עוברים טרנסדוקציה באמצעות וירוסי bao הנושאים את תת-היחידה NAV 1.2 במטרה לייצר תאי OPC בעלי יכולת ירי (spiking). התוצאות המתקבלות מראות את הביטוי של סמן OPC ותכונות ה-spiking של תאי OBC אלו המופקים מ-MESC, בהתבסס על מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה והקלטות אלקטרופיזיולוגיות. שלום, אני פונג צ'יאנג מהמעבדה של ד"ר אינג במחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. אנו קשורים גם לבית החולים שרינרס לילדים של צפון קליפורניה.שלום, אני ויאל רג' (vial Raj), גם אני מהמעבדה של דנג (Deng lab). היום נדגים לכם פרוטוקול לגביעת תאי גזע עובריים של עכבר לתאי אב של גליאל. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תכונותיהם של תאי אב לאוליגודנדרוציטים הגזורים מתאי גזע עובריים, במטרה לייצר תאים בעלי פוטנציאל טיפולי טוב יותר.אם כן, בואו נתחיל. היום נוצר תאי אב של אוליגודנדרוציטים (OPCs) מקו תאי גזע עובריים של עכבר מסוג OG2-GFP. יש להעביר תאי גזע עובריים אלה (passage) מדי שלושה ימים כדי לשמור על בריאותם בצפיפות אופטימלית ולמנוע דיפרנציאציה ספונטנית. העברה.תאי ה-ESS כאשר הם נמצאים ב-70% confluence תחת מנדף זרימה למינרית. הסר את המצע שמעל התרבית. שטוף עם PBS ובצע trypsinization עם שני מיליליטר של תמיסה שחוממה מראש.בצע סבב אחד של LE express למשך חמש דקות ב-37 °C. עצור את התגובה והשהה מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של מצע תאים MES. העבר את התאים למבחנה קונית של 15 מיליליטר והשק אותם ב-1000 RP למשך חמש דקות.השביו מחדש בצלחת עם מצע MESL, עשירית מהתאים מעל שכבה צפופה (confluent) של תאי הזנה מסוג meth שהוקרנו, במצע תאי MES. לאחר שלושה ימים, תאי ה-ES מגיעים לכ-70% צפיפות והם מוכנים למעבר (passage) או להשביה מחדש ליצירת גופי עובר (embryoid bodies) כדי להשרות היווצרות גופי עובר ולהתחיל בדיפרנציאציה. בצעו טריפסינציה לקולוניות תאי ES של עכבר כפי שבוצע בעבר, ולאחר מכן השביו את התאים מחדש במצע knockout serum replacement או במצע KSR. ספרו את התאי באמצעות הโมסיציטומטר (hemocytometer), ודללו את התרחיף ב-KSR.דללו את המדיום כך שיכיל 15,000 תאים למיליליטר, והעבירו שלושה מיליליטרים לכל באער של פלטת 6 באערים עם הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment). תרבתו את התאים התלויים ב-37 °C למשך ארבעה ימים. החליפו את המדיום באופן מלא מדי יומיים.החל מהיום הרביעי, החליפו את המצע מדי יום; ביום הרביעי הוסיפו ל-KSR חומצה רטינואית בריכוז 0.2 µM. ביום החמישי הוסיפו הן חומצה רטינואית והן primor famine בריכוז 1 µM; בימים השישי והשביעי השכילו את גופי העוברים במצעים המכילים 0.2 µM חומצה רטינואית ו-1 µM primor famine. לאחר שמונה ימים בתרבית, רוב גופי העוברים מביעים GFP ומוכנים לפירוק באמצעות טריפסין; ספרו את התאים כפי שבוצע בעבר.לאחר מכן, השהו אותם בריכוז של 3.5 × 10⁵ תאים למילליטר. בתוך מצע OPC, העבירו שלושה מילליטרים של התרחף למצע OPC. בשימוש בצלחות של 60 מילימטר מצופות פולי-אורניתין, התאים יהיו קונפלואנטים בערך מדי שבוע ויראו כך; בצעו מעבר לתאים כפי שנעשה קודם לכן עם טריפסינזציה של שלוש דקות.30 ימים לאחר השעיה ראשונית של ה-resus. במצע KSR, התאים מראים מאפיינים של תאי מקור לאוליגודנדרוציטים ליצירת OPCs בעלי פוטנציאל פעולה (spiking OPCs). השתמש ב-OPCs המופקים מ-ESL של עכבר שנמצאים ברמת התלכדות של בין 50% ל-70%.החליפו את המצע ב-XPBS כדי לשטוף את התאים. להחדרת תת-יחידה alpha של תעלת נתרון מופעלת מתח 1.2.אנו משתמשים בערכה לערוצי נתרן of back MAM. ערבבו 1 mL של רכיב A מ-back MAM עם 4 mL של 1X PBS. הסירו את שטיפת ה-PBS והוסיפו את הרכיב המדולל.דגירה ב-37 °C למשך שעתיים. החלף את סוכן הזיכרון האחורי במצע OPC המועשר ברכיבים B ו-C כפי שמתואר בערכה. דגירה למשך שעתיים נוספות ב-37 °C.לאחר הדגירה, החליפו את המדיום המועשר במדיום OPC טרי. לאחר 24 שעות נוספות של תרבית, ניתן לבדוק את ה-OPCs שהופקו מ-ESL לאיתור spiking בנקודת זמן זו. ה-EBS אינם מראים פלואורסצנציית GFP.ה-EBS מראים ביטוי חזק של GFP והם מוכנים לתרבית של פירוק (disaggregation culturing) כ-30 יום לאחר התלייה המקורית. במצע KSR, רוב התאים הם חיוביים אימונולוגית לצביעת NG2, דבר העולה בקנה אחד עם ביטוי ה-GFP. עם זאת, בניגוד ל-OPCs מהמוח, תאי OPCs אלו המופקים מתאי MES אינם מסוגלים לייצר פוטנציאלי פעולה, גם כאשר התאים דפולריזו ל-0 millivolts.לאחר הכנסת תת-יחידה של NAV 1.2 באמצעות טרנסדוקציה נגיפית, תאי OPC אלו, שנגזרים מתאי MES, נBecoming מעוררים ויורים פוטנציאלי פעולה. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להבדיל תאי גזע עובריים של עכבר לתאי OPC וליצור תאי OPC בעלי יכולת ירי (spiking) באמצעות טרנסדוקציה נגיפית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאחסן את ה-retinoid acid, ה-morphine וה-FGF two בצורה נאותה ולהשתמש תמיד במנת עבודה (aliquot) טריה, ולהשליך כל שארית של retinoid acid לאחר השימוש.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

differentiation-embryonic-stem-cells-into-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor...

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

סרטון זה מדגים את התהליך של יצירת תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מתאי גזע עובריים אנושיים, ואחריו הבשלת OPCs לאוליגודנדרוציטים. תהליך זה של יצירת אוליגודנדרוציטים פותח דרכים רבות לשיפור המחקר והטיפול במחלות נוירודגנרטיביות, כולל אלצהיימר.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאוליגודנדרוציטים

סרטון זה מדגים את הקמתה של תרבית משותפת של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מושרים (iOPCs). iNs מעורבבים עם iOPCs בתרבית משותפת ולאחר מכן מודגרים כדי לתמוך בהבשלה של iNs לנוירונים ו- iOPCs לאוליגודנדרוציטים. תאי עצב יוצרים קשרים סינפטיים עם תאי עצב ואוליגודנדרוציטים אחרים, בעוד שאוליגודנדרוציטים מפתחים מעטה מיאלין סביב אקסוני הנוירונים.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

למדו פרוטוקול להפקת תאי מבשר אוליגודנדרוציטים מתאי גזע עובריים של עכברים תוך 30 יום. השיטה משתמשת במולקולות קטנות ומייצרת OPCs יעילים לחקר מיאלינציה וטיפול במחלות נוירולוגיות.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

גלה סרטונים נוספים