Name: סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד שיטת סימון תאים בעזרת GFP ממוקד ממברנה לדימוי תאי עצב ברזולוציה גבוהה באמבריונים של Danio rerio. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקה תאית בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH הוענק ר ברוסטר (1R01GM085290-01A1).

1.Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פלסמיד קידוד קרום במיקוד גרין פלורסנט חלבון (mGFP, באדיבות ריצ'רד הרלנד) כדי בריכוז של 40 ng / ml. DNA הוא הוכן על ידי linearizing פלסמיד (mGFP/PCS2 +, באדיבות ריצ'רד הרלנד) מטוהרים באמצעות ערכת הכנה Qiagen מקסי. תוספת של פנול אדום (בדילול מלא 1 / 10 הנפח הכולל) לפתרון עדיף לדמיין את הפתרון. שמור את פתרון ה-DNA על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope, לכייל את מחט הזריקה (90mm זכוכית הנימים מ Narishinge מדעי: חתול מס 'NA-GD-1) על ידי יישור מחט בשקופית סיים בעדינות את החלק הקשה של המחט שבה הקוטר הוא 1μm באמצעות סכין גילוח נקי להב (כדי לקבל קצה בגודל המתאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לכייל את המחט להזריק נפח ידוע (2nl), לחבר את המחט למנגנון microinjection (PCI 100 Microinjector; הרווארד Apparatus) ו הקדמי למלא את המחט עם 0.5μl פתרון המכיל מים פנול אדום והניח על פיסת של פרפין. הפתרון ניתן לוותר באמצעות דוושת רגל. הגדר את הלחץ kPa 7 ולגוון את הזמן (10msec 30msec), כך שזה לוקח 250 דוושות לוותר 0.5μl של הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום מחט מכויל על רצועה של שעווה צלחת פטרי 100 מ"מ humidified. כדי ללחלח את המנה, המקום Kimwipes רטוב בקצוות (זה מונע אידוי של הפתרון את המחט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipette לטעון 0.5-1μl של דנ"א לתוך קצה המחט (בסוף זה לא היה מכויל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפתרון הגיע חוד המחט, חבר את הקצה של המחט אשר שימשה להעמסה על מנגנון microinjection. התאם את ההגדרות על microinjector לספק כ -2 nl / ההזרקה באמצעות דוושת רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, דג הזברה עמדה עוברים באמצע צלחת פטרי מלאות בינונית העובר (צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 1, 0.1 במלאי מ"ל של האנק מס '2, צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 4, 95.9 מ"ל DDH 2 O, צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 5 , צילומים של 1.0 מ"ל של טרי האנק # 6, השתמש בערך 10 טיפות NaOH M 1 ל-pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העוברים פיתחו לשלב הרצוי, בעדינות אחיזת סיסית עם מלקחיים בסדר למקם את המחט לאזור ממוקד עבור זריקה. עבור ביטוי מגוון רחב mGFP, להזריק DNA בחלמון או בציטופלסמה בשלב 1cell. כדי להגביל את הביטוי של mGFP לאזור קטן יותר, להזריק DNA ב 4 (או יותר) שלב תאים לתוך הציטופלסמה של תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על דוושת הרגל של המנגנון microinjection ולספק כ -2 nl, להבטיח כי הפתרון (גלוי בשל תוספת של פנול אדום) מוזרק כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכל העוברים בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפתח את העוברים על 28.5 ° C לשלב הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Dechorionate ידי בעדינות קילוף סיסית באמצעות מלקחיים קנס (אם עוברים בני פחות מ 24hpf, dechorionating בכלי זכוכית פטרי מעלה את שיעור ההישרדות של עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סיסית ריק מצלחת פטרי בעזרת פיפטה מזכוכית. </li></ol> 2. הדמיה mGFP שכותרתו סעיפים vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית להעביר עוברים לתוך paraformaldehyde (מחזיק 4% פתרון חיץ 1X פוספט (PBS). Fix עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים 1X PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בצלחת פטרי, באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את החלמון מבלי לפגוע בעובר. הסר כמו חלמון האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% נמוך להמיס agarose ב H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום agarose מותכת לתוך תבנית פלסטיק חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר להרים עובר מוזרק מצלחת פטרי למקום לכוון את agarose. העובר צריך להיות ממוצבת לקראת סוף אחד עובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose הוא מוקשה, להשתמש בכלי משטח שטוח, כגון מרית, כדי להסיר את הבלוק agarose מן התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה התחתון של הגוש agarose בסכין גילוח כך שהוא אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של דבק סופר לשלב vibratome והמקום לחסום agarose על זה (הצד של גוש זה התייצבה עם סכין הגילוח צריך להתמודד עם דבק). עבור חתך עוברים מרובים, הר agarose-מוטבע מספר דגימות על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הבמה vibratome את vibratome (Vibratome, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים של vibratome (ההגדרות הנפוצות: מהירות-3, עובי-50μm). אם חתך עוברים מרובים, ליישר בלוקים agarose על הבמה להבטיח כי הלהב עובר לעובר כולו, אך לא דרך רוחב כולו מאבני agarose (כך בסעיפים המתאימים העובר אותו יישארו יחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1X PBS בשלב vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם הם עוברים sectioנד, להסיר את הבלוק agarose (ים) משלב vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד כל קטע על ידי חיתוך האחורי של לחסום agarose (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים קנס כדי לבחור חלקים הרצוי מקום לתוך צלחת PBS מלא רב גם 1X (להשתמש בבארות שונים בסעיפים המתאימים עוברים שונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם תיוג נוגדן, 19 צעדים על פי 23, כדי לשפר את mGFP הדמיה (שלב זה לא עשוי להיות נחוץ אם הסעיפים הם צילמו בתוך יום או יומיים של הכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את הסעיפים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת 1X PBS לחסום הלא ספציפית מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה עם נוגדן ראשוני (ארנב-GFP, Invitrogen חתול מס 'A11122) מדולל @ 1:200 בפתרון חסימת על שייקר במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו עם נוגדנים משני חלקים המתאימים פתרון חסימת במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את החלקים עם DAPI (0.1% ב 50 מ"ל DAPI 1X PBS; Invitrogen חתול מס 'D1306) במשך 30 דקות להכתים את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 3. חיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate לחיות, עוברים מוזרק 30 דקות לפני שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. מניחים את העוברים בפתרון הרגעה (0.01% Tricaine ב בינונית העובר) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום agarose ירידה של 1% על צלחת זכוכית 35mm התחתונה תרבות (MatTek; מס 'חלק P35G-o-20-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים על אש צינור נימי לעשות 3 חורים agarose (חפצים אחרים כגון טיפים micropipette ניתן להשתמש כדי לעשות את החורים). ודא כי אין agarose שיורית בתחתית הבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צלחת פטרי עם בינונית העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית למקום העובר בתוך הבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לכוון את העובר באמצעות מלקחיים קנס כך האזור להיות צילמו (ראש הגבי) נמצא בקשר עם הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות התחבורה צלחת פטרי לשלב מיקרוסקופ (במקום המכסה מעל צלחת פטרי כדי למנוע אידוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה, להבטיח כי הם עוברים על 28.5 ° C. </li></ol> 4. תוצאות אנו מתארים כאן גישה ישירה לתאי תמונה אחת בצינור העצבי דג הזברה באמצעות הביטוי פסיפס. למרות השקיפות האופטי של העובר דג הזברה, מצאנו כי ויזואליזציה של תאים עצביים היא משופרת מאוד חתכים שהושגו באמצעות vibratome. סעיפים אלה עבה (50 מ"מ) המאפשר הדמיה של הרחבה הסלולר מתא נתון מטוסים מוקד שונים באמצעות מיקרוסקופ confocal. תוצאות השימוש במתודולוגיה זו פורסמו 2 במקום אחר, אבל נציג תמונות של התאים בצינור העצבי של העובר WT (איור 1) ו - N-cadherin (N-CAD) מוטציה (איור 2) מסופקים. האחרון מגלה כי התאים באזורים לרוחב הצלחת עצבית N-CAD מוטנטים מצליחים להתמצא כראוי כלפי קו האמצע (איור 2). בניגוד תיוג זה פסיפס, immunostaining neuroepithelium עם סמן השטח הכללי תא כגון בטא catenin אינו מאפשר את המורפולוגיה של תאים בודדים להיות דמיינו (איור 3). זמן לשגות הדמיה של עוברים לחיות השלימו את תיוג פסיפס של דגימות קבוע, דבר המאפשר הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation. סרט 1 גילה כי תאים WT פעיל לנדוד לעבר קו האמצע ידי הרחבת מדיאלית מוכווני בליטות בממברנה. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה WT. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה N-cadherin. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור ב-catenin חיסונית מכתים של neuroepithelium.

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).</li>
<li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לסיכום, שיטות תיוג המתוארת כאן לאפשר לניתוח תא בודד של תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך בעובר דג הזברה. הדגש העיקרי של פרוטוקול זה הוא על שיטות דימות תאים שכותרתו בצינור העצבי באמצעות mGFP בשליטת היזם בכל מקום. עבור יישומים נוספים של הקוראים זה assay חולף ביטוי לעיין במאמר לאחרונה על ידי אנדרסן et al. 3.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של צילומים מס &#39;1: 8.0 גרם NaCl, 0.4 גרם ב 100 מ&quot;ל KCl dd H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של צילומים מס &#39;2: 0.358 גרם Na 2 HPO 4 נטול מים, 0.60 גרם KH 2 PO 4 ב 100 מ&quot;ל DDH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של מלאי # 4: 0.72 גרם CaCl 2 ב 50 מ&quot;ל DDH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של מלאי # 5: 1.23 גרם MgSO 4 x7H 2 O ב 50 מ&quot;ל dd H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 X הצפת פוספט: 0.8% NaCl, KCl 0.02%, 0.02 מ &#39;PO4, pH 7.3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חסימת: 2% נסיוב עז רגיל, 1% שור בסרום אלבומין (BSA), dimethysulfoxide 1% (DMSO) </li></ul>

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך המעצבות את העובר החולייתנים הראשונים הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. בשנת עוברי דג הזברה, הזרקה של תוצאות ה-DNA פלסמיד בביטוי פסיפס, המאפשר ויזואליזציה של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים<sup&gt; 1</sup&gt;. אנו מתארים כיצד הזרקה של קידוד הדנ&quot;א פלסמיד קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP) בשליטת היזם בכל מקום ניתן להשתמש בתאים הדמיה עוברת neurulation. במרכז פרוטוקול זה הוא מתודולוגיה תאים הדמיה ברזולוציה גבוהה שכותרתו בסעיפים וגם בזמן אמת. פרוטוקול זה מחייב את הזריקה של ה-DNA mGFP לעוברי דג הזברה הצעיר. עוברים מעובדים ואז חתך vibratome, תיוג נוגדן הדמיה במיקרוסקופ confocal. לחלופין, עוברים לגור להביע mGFP ניתן הדמיה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בעבר הגישה הזאת פשוט לנתח את התנהגות הסלולר כי הכונן היווצרות בצינור העצבי באזור למוח האחורי של עוברי דג הזברה<sup&gt; 2</sup&gt;. ההכנות קבוע מותר להדמיה חסר תקדים של צורות התא הארגון הצינור העצבי בעוד הדמיה לחיות השלים גישה זו המאפשרת הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation.

מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

המפתח להבנת התהליכים המורפוגנטיים המעצבים אתו שלו של עוברי חוליתנים בשלביהם המוקדמים הוא היכולת לדגם תאים ברזולוציה גבוהה. בדגי זברה...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לדמות תאי עצב ברזולוציה גבוהה בעובר של דג הזברה. ראשית, מוזרק DNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכוון לממברנה לתוך עובר דג זברה בשלב התא הבודד, דבר המוביל לירושה פסיפסית (mosaic inheritance) ובכך מאפשר דימוי משופר של תאים מפוזרים. לאחר מכן, העוברים מסומנים אימונולוגית באמצעות נוגדן anti-GFP ונחתכים, מה שמאפשר ויזואליזציה של המורפולוגיה של תאים בודדים ברזולוציה גבוהה בדגימה מקובעת. לחלופין, ניתן לבחון עוברים חיים באמצעות מיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse כדי לדמות דינמיקה תאית.התוצאות המתקבלות מציגות מורפולוגיה או דינמיקה של תאים. כאן, המוח האחורי של דג הזברה מצולם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום לכולם.אני PR Chandran מהמעבדה של ד"ר Rachel Brewster במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. היום נדגים לכם פרוצדורה לסימון והדמיה של תאי עצב בעוברים של zebrafish ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את מנגנוני הנוירו-רגולציה בעוברים של zebrafish ברמה התאית.אם כן, נתחיל. הניחו ניגוני Kim wipes רטובים מסביב לקצה של צחנת פטרית בקוטר של 100 מילימטר.קבעו בזהירות מחט מיקרו-הזרקה מזכוכית על רצועת שעווה בתוך הצלחת הלחה. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי למשח (dissecting stereo microscope), יישרו את המחט מול סרגל זכוכית מדורג. כדי להשיג קצה בגודל המתאים, השתמשו בלהב תער נקי כדי להקיש בעדינות על המחט בנקודה שבה קוטרה הוא 1 µm.חבר את המחט לפיפט של מכשיר המיקרו-הזרקה, טפטף 0.5 µL של תמיסת phenol red ומים על פארא-פילם (para film) ומלא את המחט מהטיפות. הגדר את לחץ המיקרו-הזרקה ל-7 kPa והתחל עם פולס של 20 ms. ספור את מספר הפולסים הדרושים להזרקת כל הנוזל. שנה את זמן הפולס בטווח של 10 עד 30 ms כך שיידרשו כ-250 פולסים לריקון הנוזל.0.5 מיקרוליטר מהתמיסה. השתמשו במיקרופיפט כדי למלא לאחור את המחט עם 0.5 עד 1 מיקרוליטר של MG FPD NA במים, מעורבב עם פנול אדום לצורך ויזואליזציה. כסו את הצלחת הלחה כדי למנוע התאיידות של התמיסה מהמחט תחת מיקרוסקופ הסטריאו.מקמו עוברים של דגים בשלב של תא אחד בנפרד בתוך צלחת פטרי של 60 מילימטר המלאה ב-embryo.Medium. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס בעדינות את ה-chorion ולייצב את העובר. העבירו את המחט המלאה ב-MGFP ו-phenol red אל אזור היעד להזרקה.עבור ביטוי MGFP בטווח רחב, הזרק לתוך החלון או לתוך הציטופלזמה. השתמש במכשיר למיקרו-הזרקה כדי להחדיר כ-2 nanoliters של תמיסת ה-MGFP. עקוב אחר מיקומו של אינדיקטור ה-phenol red כדי לאשש את ביצוע ההזרקה כראוי.הוצאו בזהירות את המחט מהעובר. הזריקו את כל העוברים שבצלחנה, עד 30 עוברים בכל פעם. הימנעו מחשיפת העוברים לאור והדגירו בטמפרטורה של 28.5 °C כדי לאפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי.השתמשו בפינצטה עדינה כדי לקלף בעדינות את ה-Corian מהעוברים. השתמשו בפיפטת פסטה כדי להוציא את ה-corian הריק מהצלחת, כך שיישארו רק העוברים המצופים ב-dec. השתמשו בפיפטת פסטה שעברה ליטוש באש כדי להעביר את העוברים המוזרקים והמצופים אל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.הסר כמה שיותר מצע עודף, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של ative. שטוף את העוברים בטמפר 1X PBS בטמפרטורת החדר שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. העבר את העוברים לצחנית פטרי מלאה ב-1X PBS תחת מיקרוסקופ סטריאו.השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק את העובר בקרבת אזור הזנב. השתמשו בסט שני של פינצטה או במוט דחיקה (poker) כדי לנסות להסיר כמה שיותר yo מבלי לגעת באזור המסגרת האחורית. תוך התבוננות תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה העדינה כדי להרים את העובר מהצלחת ולהעבירו לתבנית חיתוך מלאה ב-4% low melting point Aros.מקמו את העובר לכיוון קצה אחד של התבנית. המתינו שה-aros יתגבש בטמפרטורת החדר. השתמשו בשפכד כדי להוציא את בלוק ה-aros שהתגבש מהתבנית, ובסכין בעלת להב מורם חתכו את הקצה התחתון של הבלוק באופן אחיד.השתמשו בטיפה של דבק מהיר (super glue) כדי לקבע את הבלוק לבמת הוויברטום, כאשר הצד החתוך פונה כלפי מטה במידת הצורך. יישרו מספר בלוקים על הבמה. חברו את הבמה לוויברטום.וודאו שהלהב יחתוך את כל העוברים במלואם, אך לא יעבור לחלוטין דרך הבלוק. מלאו את המשטח במקטע אחד של XPBS. חתכו בזהירות את העוברים עד לסוף בלוק ה-arou והעבירו אותם לצלוחית פטרי המולאה ב-XPBS אחד.הפרידו את החתכים תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להעביר את החתכים הרצויים לכלי עם מספר בארות המולא ב-1xPBS. השתמשו בבארה נפרדת עבור כל עובר.צבע את החתכים באמצעות DPI ובצע סימון אימונו-היסטוכימי עם anti GFP. אם לא בוצע, יש לבצע הדמיה תוך 48 שעות. רכב עד שישה חתכים על כל שקופית והנח זכוכית כיסוי מעל החתכים לצורך הדמיה קונפוקלית.יש לאחסן את העגיות בחושך כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching). במהלך הדימוי החי, יש להגן על העוברים שהוזרקו ב-MGFP מפני אור. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את העוברים 30 דקות לפני שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי.העבירו את העוברים המצופים לתמיסת הרגעה של מדיום עוברים עם 0.01% Trica והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. טפטפו בעזרת פיפטה טיפה של 1% regular agarose במים לתוך צלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר, כך שהיא תמלא את התבנית. המתינו עד שהאגרז יתקשח.השתמש בצינור קפילריה מזכוכית באורך 90 מילימטר כדי ליצור שלושה חורים בטיפת ה-aros תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. בדוק את תחתית הבאר והסר שאריות aros בעזרת פינצטה. מלא את הצלחת בתרגיד לעוברים תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי.השתמשו בפיפטת פסטה כדי להעביר עובר אחד לכל חור במערך. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לכוון את העובר כך שהאזור המבוקש, במקרה זה הראש הדורסלי, ירחף כנגד הזכוכית. כסו את הצלחת.העבירו בזהירות את הצלחת לבמתו של מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמשו במחממי חלל כדי לשמור על העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C לאורך כל תהליך הדימוי. כאן מוצג חתך דרך המוח האחורי של עובר מסוג wild type בשלב של ארבעה עד חמישה סומריטים, המסומן בסמנים כפולים: GFP המכוון לממברנה בירוק ו-D בכחול; רק תא אחד מסומן ב-GFP קשור לממברנה, מה שמאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה והארגון התאיים.זוהי תמונה השוואתית של המוח האחורי של מוטנט nardi בשלב של ארבעה עד חמישה סומריטים. תמונה זו חושפת כי התאים במוטנטים של nardi אינם מצליחים להתכוון כראוי לעבר קו האמצע במהלך נוירו-רבלאציה. בניגוד לשיטה לסימון תאים באמצעות MGFP, סימון של המוח האחורי באמצעות סמן כללי לפני השטח של התא כגון beta-catenin אינו מאפשר ויזואליזציה של המורפולוגיה של תאים בודדים.דימות בשיטת Time-lapse של המוח האחורי של עובר מסומן ב-MG FP חושף כי התנהגויות התאים המניעות את הניורולציה בדג zebrafish הן דינמיות מאוד וכוללות התארכות של בליטות ממברנה בעוד התאים נודדים ומתגבשים. הראינו לכם כיצד להכין עוברים של zebrafish, הן מקובעים והן חיים, לדימות של תא בודד ברזולוציה גבוהה. זהו כל התהליך.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

labeling-and-imaging-cells-in-the-zebrafish-hindbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

סרטון זה מתאר את הטכניקה של מיקרודיסקציה של המוח מדג זברה בוגר. שיטה זו מסייעת בהשגת נויאורוספירות שמקורן במוח שלם שניתן ללמוד עוד יותר.

דיסקציה מוחית של דגי זברה: טכניקה של נוירוביולוגיה של דגים

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

למד שיטת סימון תאים בעזרת GFP ממוקד ממברנה לדימוי תאי עצב ברזולוציה גבוהה באמבריונים של Danio rerio. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקה תאית בזמן אמת.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

גלה סרטונים נוספים