סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה
25 ביולי 2010
מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לדמות תאי עצב ברזולוציה גבוהה בעובר של דג הזברה. ראשית, מוזרק DNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכוון לממברנה לתוך עובר דג זברה בשלב התא הבודד, דבר המוביל לירושה פסיפסית (mosaic inheritance) ובכך מאפשר דימוי משופר של תאים מפוזרים. לאחר מכן, העוברים מסומנים אימונולוגית באמצעות נוגדן anti-GFP ונחתכים, מה שמאפשר ויזואליזציה של המורפולוגיה של תאים בודדים ברזולוציה גבוהה בדגימה מקובעת. לחלופין, ניתן לבחון עוברים חיים באמצעות מיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse כדי לדמות דינמיקה תאית.
התוצאות המתקבלות מציגות מורפולוגיה או דינמיקה של תאים. כאן, המוח האחורי של דג הזברה מצולם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום לכולם.
אני PR Chandran מהמעבדה של ד"ר Rachel Brewster במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. היום נדגים לכם פרוצדורה לסימון והדמיה של תאי עצב בעוברים של zebrafish ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את מנגנוני הנוירו-רגולציה בעוברים של zebrafish ברמה התאית.
אם כן, נתחיל. הניחו ניגוני Kim wipes רטובים מסביב לקצה של צחנת פטרית בקוטר של 100 מילימטר.
קבעו בזהירות מחט מיקרו-הזרקה מזכוכית על רצועת שעווה בתוך הצלחת הלחה. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי למשח (dissecting stereo microscope), יישרו את המחט מול סרגל זכוכית מדורג. כדי להשיג קצה בגודל המתאים, השתמשו בלהב תער נקי כדי להקיש בעדינות על המחט בנקודה שבה קוטרה הוא 1 µm.
חבר את המחט לפיפט של מכשיר המיקרו-הזרקה, טפטף 0.5 µL של תמיסת phenol red ומים על פארא-פילם (para film) ומלא את המחט מהטיפות. הגדר את לחץ המיקרו-הזרקה ל-7 kPa והתחל עם פולס של 20 ms. ספור את מספר הפולסים הדרושים להזרקת כל הנוזל. שנה את זמן הפולס בטווח של 10 עד 30 ms כך שיידרשו כ-250 פולסים לריקון הנוזל.
0.5 מיקרוליטר מהתמיסה. השתמשו במיקרופיפט כדי למלא לאחור את המחט עם 0.5 עד 1 מיקרוליטר של MG FPD NA במים, מעורבב עם פנול אדום לצורך ויזואליזציה. כסו את הצלחת הלחה כדי למנוע התאיידות של התמיסה מהמחט תחת מיקרוסקופ הסטריאו.
מקמו עוברים של דגים בשלב של תא אחד בנפרד בתוך צלחת פטרי של 60 מילימטר המלאה ב-embryo.Medium. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס בעדינות את ה-chorion ולייצב את העובר. העבירו את המחט המלאה ב-MGFP ו-phenol red אל אזור היעד להזרקה.
עבור ביטוי MGFP בטווח רחב, הזרק לתוך החלון או לתוך הציטופלזמה. השתמש במכשיר למיקרו-הזרקה כדי להחדיר כ-2 nanoliters של תמיסת ה-MGFP. עקוב אחר מיקומו של אינדיקטור ה-phenol red כדי לאשש את ביצוע ההזרקה כראוי.
הוצאו בזהירות את המחט מהעובר. הזריקו את כל העוברים שבצלחנה, עד 30 עוברים בכל פעם. הימנעו מחשיפת העוברים לאור והדגירו בטמפרטורה של 28.5 °C כדי לאפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי.
השתמשו בפינצטה עדינה כדי לקלף בעדינות את ה-Corian מהעוברים. השתמשו בפיפטת פסטה כדי להוציא את ה-corian הריק מהצלחת, כך שיישארו רק העוברים המצופים ב-dec. השתמשו בפיפטת פסטה שעברה ליטוש באש כדי להעביר את העוברים המוזרקים והמצופים אל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.
הסר כמה שיותר מצע עודף, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של ative. שטוף את העוברים בטמפר 1X PBS בטמפרטורת החדר שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. העבר את העוברים לצחנית פטרי מלאה ב-1X PBS תחת מיקרוסקופ סטריאו.
השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק את העובר בקרבת אזור הזנב. השתמשו בסט שני של פינצטה או במוט דחיקה (poker) כדי לנסות להסיר כמה שיותר yo מבלי לגעת באזור המסגרת האחורית. תוך התבוננות תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה העדינה כדי להרים את העובר מהצלחת ולהעבירו לתבנית חיתוך מלאה ב-4% low melting point Aros.
מקמו את העובר לכיוון קצה אחד של התבנית. המתינו שה-aros יתגבש בטמפרטורת החדר. השתמשו בשפכד כדי להוציא את בלוק ה-aros שהתגבש מהתבנית, ובסכין בעלת להב מורם חתכו את הקצה התחתון של הבלוק באופן אחיד.
השתמשו בטיפה של דבק מהיר (super glue) כדי לקבע את הבלוק לבמת הוויברטום, כאשר הצד החתוך פונה כלפי מטה במידת הצורך. יישרו מספר בלוקים על הבמה. חברו את הבמה לוויברטום.
וודאו שהלהב יחתוך את כל העוברים במלואם, אך לא יעבור לחלוטין דרך הבלוק. מלאו את המשטח במקטע אחד של XPBS. חתכו בזהירות את העוברים עד לסוף בלוק ה-arou והעבירו אותם לצלוחית פטרי המולאה ב-XPBS אחד.
הפרידו את החתכים תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להעביר את החתכים הרצויים לכלי עם מספר בארות המולא ב-1xPBS. השתמשו בבארה נפרדת עבור כל עובר.
צבע את החתכים באמצעות DPI ובצע סימון אימונו-היסטוכימי עם anti GFP. אם לא בוצע, יש לבצע הדמיה תוך 48 שעות. רכב עד שישה חתכים על כל שקופית והנח זכוכית כיסוי מעל החתכים לצורך הדמיה קונפוקלית.
יש לאחסן את העגיות בחושך כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching). במהלך הדימוי החי, יש להגן על העוברים שהוזרקו ב-MGFP מפני אור. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את העוברים 30 דקות לפני שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי.
העבירו את העוברים המצופים לתמיסת הרגעה של מדיום עוברים עם 0.01% Trica והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. טפטפו בעזרת פיפטה טיפה של 1% regular agarose במים לתוך צלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר, כך שהיא תמלא את התבנית. המתינו עד שהאגרז יתקשח.
השתמש בצינור קפילריה מזכוכית באורך 90 מילימטר כדי ליצור שלושה חורים בטיפת ה-aros תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. בדוק את תחתית הבאר והסר שאריות aros בעזרת פינצטה. מלא את הצלחת בתרגיד לעוברים תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי.
השתמשו בפיפטת פסטה כדי להעביר עובר אחד לכל חור במערך. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לכוון את העובר כך שהאזור המבוקש, במקרה זה הראש הדורסלי, ירחף כנגד הזכוכית. כסו את הצלחת.
העבירו בזהירות את הצלחת לבמתו של מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמשו במחממי חלל כדי לשמור על העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C לאורך כל תהליך הדימוי. כאן מוצג חתך דרך המוח האחורי של עובר מסוג wild type בשלב של ארבעה עד חמישה סומריטים, המסומן בסמנים כפולים: GFP המכוון לממברנה בירוק ו-D בכחול; רק תא אחד מסומן ב-GFP קשור לממברנה, מה שמאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה והארגון התאיים.
זוהי תמונה השוואתית של המוח האחורי של מוטנט nardi בשלב של ארבעה עד חמישה סומריטים. תמונה זו חושפת כי התאים במוטנטים של nardi אינם מצליחים להתכוון כראוי לעבר קו האמצע במהלך נוירו-רבלאציה. בניגוד לשיטה לסימון תאים באמצעות MGFP, סימון של המוח האחורי באמצעות סמן כללי לפני השטח של התא כגון beta-catenin אינו מאפשר ויזואליזציה של המורפולוגיה של תאים בודדים.
דימות בשיטת Time-lapse של המוח האחורי של עובר מסומן ב-MG FP חושף כי התנהגויות התאים המניעות את הניורולציה בדג zebrafish הן דינמיות מאוד וכוללות התארכות של בליטות ממברנה בעוד התאים נודדים ומתגבשים. הראינו לכם כיצד להכין עוברים של zebrafish, הן מקובעים והן חיים, לדימות של תא בודד ברזולוציה גבוהה. זהו כל התהליך.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה לדימות ברזולוציה גבוהה של תאים עצביים בעוברים של דגי זברה באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכוון לממברנה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של תאים בודדים והדינמיקה שלהם, ובכך מספקת תובנות לגבי תהליכים מורפוגנטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- הבנת ההתפתחות העוברית היא קריטית לביולוגיה של ההתפתחות.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה הן חיוניות לחקר מורפולוגיה של תאים.
- דגי Zebrafish משמשים כאורגניזם מודל בשל העובריים השקופים.
- חלבונים פלואורסצנטיים המכוונים לממברנה משפרים את יכולות הדימות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לסימון והדמיה של תאי עצב בעוברי דגי זברה.
- מתן אפשרות לוויזואליזציה של מורפולוגיית תאים ודינמיקה ברזולוציה גבוהה.
- סיוע בחקר תהליכים מורפוגנטיים במהלך ההתפתחות המוקדמת.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הזרקת DNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכוון לממברנה לעוברים בשלב התא הבודד.
- הורשה פסיפסיסטית (mosaic) מאפשרת דימות משופר של תאים מפוזרים.
- סימון אימונולוגי באמצעות נוגדן anti-GFP לדגימות מקובעות.
- דימות חי באמצעות מיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse לצפייה בדינמיקה תאית.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מורפולוגיה של תא בודד בעוברים של דג הזברא.
- דימוי דינמי של תאי עצב בעוברים חיים.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיית המוח האחורי של דג הזברא.
- התוצאות מדגימות את יעילותה של טכניקת ההדמיה.
מסקנות
- הטכניקה מספקת כלי רב עוצמה לחקר ההתפתחות העוברית.
- דימיון ברזולוציה גבוהה יכול לחשוף תובנות לגבי דינמיקה תאית.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים שונים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאי ברזולוציה גבוהה בעוברי זבבורג (zebrafish) מאפשר ויזואליזציה מדויקת של מורפולוגיית תאי עצב והתנהגויות דינמיות במהלך ההתפתחות המוקדמת. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) ובתיקוף מטרות במסלולי מחקר של התפתחות עצבית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור שלבי גילוי מוקדמים ומחקרים תרגומיים המערבים מערכות עצביות של חולייתנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מורפוגנזה עצבית ברזולוציה של תא בודד לצורך הבהרת מסלולים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הדמיה של אוריינטציית תאים ונדידה במהלך נוירוגנזה.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים באמצעות תצפית ישירה על התנהגויות תאיות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאושרים של דגי זבראפיש עבור בדיקות המשך מבוססות דימוי.
- מסטנדרט את פרוטוקולי סימון התאים והדימוי לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר סריקה רחבה של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות המשפיעות על ההתפתחות העצבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מערכות רלוונטיות למחלות על ידי מידול של התפתחות צינור העצבים בחוליות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצרי דימוי של תאים חיים ותאים מקובעים.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס פנוטיפים התפתחותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מתודולוגיית דימוי זו משתלבת ברצף המוקדם משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות ובמחקרים מכניסטיים של התפתחות עצבית בח الفقריים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת ניתוח מבוסס היפותזות של התנהגויות תאי עצב ותהליכים מורפוגנטיים.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מחקרים השוואתיים.
- אנליטיקה: מספקת מדדים מורפולוגיים ודינמיים עתירי תוכן להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של התפתחות עצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות לשימוש חוזר עבור חקירות מגוונות של התפתחות עצבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות אספקת ראיות ישירות לפנוטיפים תאיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים להתפתחות נוירולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בעוברים של zebrafish ובטכניקות של מיקרו-הזרקה.
- נדרשת גישה לתשתית של מיקרוסקופיה קונפוקלית וסימון אימונולוגי.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדמיה וסימון.
- ייתכן הצורך בהתאמה לשלבים התפתחותיים שונים או לרקעים גנטיים שונים.
- הבהרה פוטו-כימית (Photo-bleaching) וביטוי פסיפסי הן מגבלות מעשיות שיש להביאם בחשבון.
