Name: In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: למד הפרדת אורגנלות לפי צפיפות בעוברי Drosophila חיים באמצעות צנטריפוגה. שיטה זו מאפשרת ניסויים קולוקליזציה וניתוח ביוכימי ללא שבירת תאים ומזעור ארטיפקטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים סוזן Gerbi, היידי סמית, דיוויד למברט לאספקת חומר למבחן ב-vivo צנטריפוגה על Sciara coprophila ו Ilyanassa obsoleta, בהתאמה. אנו מודים לחברי במעבדה Welte הערות על הטכניקה ואת כתב היד. פיתוח ועידון של assay ב-vivo צנטריפוגה נתמך על ידי מענק NIGMS GM64687 אל לוע. התמונות באיור. איור 1 ו. 5E, F פורסמו 2 והם נדפס כאן באישור.

<ol><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).</li>
<li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).</li>
<li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((unpublished+observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">unpublished observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).</li>
<li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport%3A+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li>
<li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+XXII%3A+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Embryology%22%5BJournal%5D)">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

צעדים קריטיים ודא כי ריכוז אגר גבוה מספיק. אם זה נמוך מדי, אגר יהיה להתפורר במהלך צנטריפוגה, ואת העוברים יתפוצץ או להיות מכוונת באופן אקראי. אם ריכוז אגר הוא רק מעט נמוך מדי או אם אגר הוא רטוב (הסרת יבש מספיק או לא מספיק עודף של TSS בשלב 4.3), העוברים יצוף מתוך החורים שלהם במהלך צנטריפוגה ולהיות מכוונת כראוי. אם אגר הוא שפך דק מדי, זה יהיה גם התמוטטות או סדק במהלך צנטריפוגה. ודא כי עוברי לא מתקדמים מעבר בשלבים cellularization. אחרת, ההפרדה של אברונים לא יעבוד (איור 5c) מאז האברונים יהיה מוחרם בתוך אלפי תאים בודדים. בשנת עוברים הצעיר בשלב אחד את התא, האברונים חופשיים לנדוד מרחקים גדולים ולצבור לפי צפיפות מאפיין שלהם. כדי למנוע ניתוח עוברים כי הם זקנים מדי, הקפד (i) כולל אוסף מראש כדי לאפשר לנקבות להטיל ביצים הישן (שלב 2.4), (ii) לאסוף עוברים במשך 3 שעות או פחות (שלב 2.5), (iii) ויזואלית לבחור עוברים שלבים לפני cellularization להטבעת לתוך אגר (שלב 4.2), (ד) לשמור על הטבעה זמן קצר כדי למנוע התפתחות עד סוף cellularization (שלב 4.6), ו (v) לבטל את העוברים שלא שכבת נכונה (שלב 5.6) . לא לקמץ על הזמן צנטריפוגה. למרות שחלק עוברים יראה שכבות נחמד גם אחרי 10 דקות בלבד של צנטריפוגה, ההפרדה אינה עולה בקנה אחד מעובר לעובר. 30 דק &#39;ספינים לתת תוצאות עקביות מאוד. כמו כן, עוד פעם צנטריפוגה, ככל השכבות יציבים לאחר צנטריפוגה הסתיים. זה חשוב עבור יישומים אלה שבהם זה לוקח זמן לתהליך עוברים עוד לפני השימוש (למשל, אם הם צריכים להיות מעובד לניסויים השתלה או רכוב לניתוח confocal). שינויים אפשריים אוסף ביצה הסרת סיסית פרוטוקולים שונים רבים קיימים שלבים 2 ו -3 1, 3, 9, ו יעבוד כמו גם אלה שתוארו כאן, כל עוד נעשה שימוש בעוברים צעירים, ביצה תשואה גבוהה, את החלק היחסי של אי - עוברים מבוים ממוזער. Anterior-האחורי יישור הפרוטוקול מכוונת כל כך עוברים את הקצה האחורי קבור אגר ואת הקצה הקדמי הוא מעלה (איור 3). האוריינטציה זה טוב עקביות, כך אפשר להשתמש micropyle כציון דרך אשר בסופו הצביעה במהלך צנטריפוגה (איור 1, 5). עם זאת, בפועל, קל לבחור את הכיוון של עוברי centrifuged על ידי הופעתו שונים של טיפות השומנים שכבות חלמון על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר מכן ניתן יהיה הר עוברים עם צד למעלה; גמישות זה מזרז את תהליך ההרכבה. צנטריפוגה Unoriented ההיבט ביותר זמן רב מאתגר מבחינה טכנית של הפרוטוקול הוא מקבע את העוברים אגר (שלב 4). זה דורש נוגעים זה עובר פעמיים (פעם אחת כדי להכניס אותו לתוך החור פעם לשחזר אותה לאחר צנטריפוגה). כחלופה, ניתן להעביר עוברים בשלב 4.1 לתוך צינורות microcentrifuge מלא TSS. כאשר אלה הם צינורות centrifuged ב microcentrifuge (13,000 סל&quot;ד, 10-30 דקות), עוברים גם בדרך כלל גם שכבת 10-13. וריאציה זו מאפשרת לתהליך מאות העוברים באותו זמן מהר מאוד. ואולם, layering אינו עקבי כמו; שבריר של עוברי לא לפתח שכבות נפרדות למרות כוחות צנטריפוגה הרבה יותר גבוה (~ 16000 ז) מאשר ליישם בפרוטוקול לעיל. מאתגר יותר היא העובדה כי הכיוון של עוברים הוא משתנה, ניתן לראות הפרדה בזוויות שונות על ציר מרכזי העובר. השתנות זו דורשת הנסיין לברר לאחר צנטריפוגה איך עובר מסוים הוסדר בצינור צנטריפוגות. עם השימוש autofluorescence החלמון כסמן החלק הכי צפופה של העובר, זה בדרך כלל אפשרי, למרות שזה דורש תרגול הרבה יותר שיקול דעת לעשות את זה אמין. אם יש עוברים מספיק במדגם, אחד עשוי להיות מסוגל למיין את אותם מקרים שבהם עוברים במקרה מסודרים כמו באיור. 1. צנטריפוגה של עוברים במעטפת ביצה שלהם אפשר להטביע עוברים אגר עבור לשלב 4 מבלי להסיר את סיסית הראשון 2. בגישה זו, עוברים על הצלחת אוסף מכוסים שמן halocarbon במקום אקונומיקה 50% בשלב 3.2 (halocarbon הופך את שקוף סיסית). עוברים שלבים המתאימים נבחרים ומועברים צלחת אגר חדש באמצעות פינצטה; על ידי תופס רק את החוטים ביצה עם פינצטה, נזקראוי העובר הוא התחמק. עוברים המוטבעים כמו בשלב 4.4 דרך 4.8, עם חוטים ביצה קדמית מזדקרת מתוך החור אגר. הפגז ביצה יוסר על ידי טיפול אקונומיקה 50% לאחר עוברים כבר centrifuged וחפרו מתוך אגר כמו בשלב 5.4. צנטריפוגה בנוכחות הקליפה ביצה עשויה לשפר את שיעור devitellinization לאחר קיבוע (שלב 6.2), אבל הבחירה של השלבים הנכונים עבור צנטריפוגה (שלב 4.2) הוא יותר מאתגר. יישומים צנטריפוגה העובר הוא שימושי במיוחד עבור ניסויים colocalization, כלומר, לבדוק אם חלבון מסוים localizes ל אברון מרכזי מסוים. לדוגמה, החלבון קלר קיים מוקדם על טיפות השומנים עובריים, אך לוקליזציה זה מאתגר להפגין עוברים ללא פגע. בחלקו, זה בגלל שתי puncta קלר ואת טיפות השומנים נמצאים בשפע בפריפריה העובר 10, מה שהופך colocalization מזויף קשה לשלול. עם זאת, צנטריפוגה מתרכז טיפות לתוך שכבת השומנים ברורה, ולכן, colocalization עם האות קלר הופך ברור 10. ניתוח דומה הוכיחה באופן חד משמעי לוקליזציה של חלבונים אחרים טיפות השומנים 8, 13-15, כולל דוגמאות מפתיע כמו ההיסטונים מסוימים 2 ו במקרים בהם החלבון נמצא בכל מקום בגוף, אך מועשר על טיפות השומנים 8. כאשר עוברים ניתן לבחור חזותית על ידי השלב ההתפתחותי (שלב 4.2), אפשר גם לזהות גיוס מוסדר מבחינה התפתחותית של חלבונים טיפות השומנים 8, 15. בדיקת colocalization עם טיפות השומנים קל במיוחד מאז טיפות השומנים מצטברים &quot;כובע&quot; מובחנת מבחינה ויזואלית, ולכן אין סמן נוסף או כתם נדרש לזהות את השכבה. למעשה, בגלל הקלות שלה והתוצאות חזותי מרשים בפוטנציה (איור 1, איור. 5 D, E), המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו באופן שגרתי עכשיו מבחן ראשון האם חלבון הוא מועמד מקומי על טיפות השומנים. באופן עקרוני, מחקרים colocalization דומה צריך לעבוד על אברונים אחרים באיור. 1, וסביר עבור אחרים (כולל טפילים תאיים) אשר הפצה עוברים centrifuged טרם תועדו. מאז צנטריפוגה מתרכז האברונים לתוך להקות חזק, זה מאפשר בידוד של חלק המועשר אברונים אלה. גישה זו כבר בשימוש להתאושש טיפות השומנים להשתלה לעוברי תורם 2. זה יכול להיות גם אפשרי ביוכימית לנתח את השבר מועשר (למשל, על ידי חיתוך שכבות את העוברים לאחר קיבוע 15). השיטה המתוארת כאן יש יישומים מעבר עוברים תסיסנית, כמו צנטריפוגה ניתן להשתמש כדי לרבד את הביצים של מינים שונים (כולל צפרדעים, נמטודות, tunicates, annelids, קיפודי ים, רכיכות, צורבים ו) 16. במעבדה שלנו, השתמשנו בפרוטוקול לעיל עוברים של Musca זבוב domestica 2 יש המועסקים צנטריפוגה unoriented בניתוח של עוברים מן יתוש פטרייה Sciara coprophila 17 ועל חילזון Ilyanassa obsoleta 17. לבסוף, שיטה זו אינה מוגבלת עוברי: צנטריפוגה יכולה להיות שימושית גם כדי לרבד תאים גדולים אחרים, כגון ביציות (למשל, תסיסנית 2, 18 ו - באג פרח חלבלוב Oncopeltus fasciatus 17). עבור הדגימה שונה, התנאים צנטריפוגה המדויק צריך להיות מותאם: לדוגמה, 10 דקות ב 3000 גרם די ביעילות לרבד בעוברים של Musca domestica 2, ואם centrifuged עוד הרבה זמן, העוברים נוטים להתפרק במהלך קיבוע ו immunostaining.

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>מבית Falcon</td></tr><tr><td>רשת חוטית</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>פלדת אל-חלד מסוג 304; גודל רשת #150 x150, קוטר חוט: 0.0026 inches</td></tr><tr><td>מחטי טונגסטן</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>מחזיק סיכות/מחטים מצופה ניקל של Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>כלובי זבובים</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 or 59-101</td><td>עבור צלחות פטרי בקוטר 65 mm או 100 mm, בהתאמה</td></tr><tr><td>שמן Halocarbon 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

האסטרטגיה העיקרית מטהרים לבודד סוגים שונים של אברונים תאיים היא להפריד אותם זה מזה מבוסס על הבדלים בצפיפות קליל. עם זאת, כאשר התאים הם שיבשו לפני, חלבונים צנטריפוגה ואת האברונים בסביבה לא דובר זה לעתים קרובות באופן בלתי הולם לדבוק זה בזה. כאן אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות שלם, החיים עוברים תסיסנית. עוברי מוקדם לפני cellularization נקצרים מהכלובים האוכלוסייה, ופצצות החיצוני שלהם ביצה יוסרו על ידי טיפול עם אקונומיקה 50%. העוברים מועברים לצלחת אגר קטן ונוסף, סוף האחורי הראשונה, לתוך חורים אנכיים קטנים אגר. לוחיות המכילות עוברים המוטבע centrifuged למשך 30 דקות בכל 3000g. אגר תומכת עוברים ושומר אותם בכיוון מוגדר. לאחר מכן, עוברים הם חפרו מתוך אגר עם מחט קהה. צנטריפוגה המפרידה האברונים העיקריים לתוך שכבות נפרדות, ריבוד גלוי בקלות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. מספר סמנים ניאון זמינים לאשר ריבוד מוצלח עוברים חיים. חלבונים הקשורים אברונים מסוימים יהיה מועשר בשכבה מסוימת, הוכחת colocalization. שכבות בודדת ניתן לשחזר לניתוח השתלת ביוכימית או ביצים לתוך התורם. טכניקה זו חלה על הפרדה אברון בתאים גדולים אחרים, כולל ביצים וביציות של מינים שונים.

אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות המגורים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים. עוברים המוטבעים אגר ו centrifuged. טכניקה זו התשואות ההפרדה לשחזור של האברונים העיקריים לאורך הציר הקדמי, האחורי את העובר. שיטה זו מקלה על ניסויים colocalization והתשואות שברים אברון לניתוח השתלת ניסויים ביוכימיים.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

אסטרטגיה מרכזית לטיהור ובידוד של סוגים שונים של אברונים תוך-תאיים היא הפרדתם זה מזה על בסיס הבדלים ב...

הפרדת האברונים המרכזיים בתוך ביצי זבוב פירות לפי צפיפות מתחילה באיסוף עוברים שבגילם פחות משלוש שעות. לאחר מכן, קליפות הביצים מוסרות על ידי דגירה ב-50% bleach לאחר קישוט. עוברים בשלבים מוגדרים מורכבים באגר.כשלב סופי, העוברים עוברים סנטריפוגה ומוחזרים, ובדיקה של העוברים שחולצו מתבצעת באמצעות אור בהיר ופלואורסצנציה. מיקרוסקופיה מראה את המיקום של חלבונים ספציפיים באברונים מסוימים. אסטרטגיה מרכזית לניקוי ובידוד של אברונים תוך-תאיים היא הפרדתם מכל שאר רכיבי התא על פי צפיפות, אך קיים אתגר שבו תאים מפורקים לפני הסנטריפוגה, דבר גורם לחלבונים ואברונים שבדרך כלל מופרדים להיות מעורבבים.מולקולות נצמדות זו לזו תחת תנאי in vitro לא טבעיים אלה. לעומת זאת, חלק מהחלבונים עלולים להתנתק ממבנים שאליהם הם נקשרים בדרך כלל. היתרון המרכזי של הטכניקה שאנו עומדים לתאר הוא שהיא מאפשרת הפרדה לפי צפיפות in vivo.כך, היא נמנעת מפיצוח תאים ומהארטיפקטים הנלווים לכך. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של התא. היא מקלה מאוד על ניסויי קולוקליזציה ומאפשרת בידוד של פראקציות אבייריות ספציפיות לצורך ניסויי השתלה ולניתוח ביוכימי.בנוהל זה, מכינים מצע אגר בריכוז גבוה המכיל מיץ תפוחים ומוזגים אותו לצלחות כפי שמתואר בפירוט בפרוטוקול הכתוב המצורף. הצלחות משמשות הן בשלב הטלת הביצים והן לשלבי ההטמעה והצנטריפוגציה העוקבים של העוברים. נוהל זה מתחיל בתחילת איסוף הביצים.ראשית, הכינו משחת שמרים על ידי ערבוב שמרים יבשים עם מים עד לקבלת סמיכות של חמאת בוטנים. לאחר מכן, כסו חלק מצעת אגר עם מיץ תפוחים טרי במשחת השמרים. זבובים בוגרים נשמרים בכלובים שאליהם מוצמדות צלחות אגר בתחתיתם.כדי להוציא את הפלטה הנוכחית, הפוך את כלוב הזבובים והקש עליו בחוזקה על גבי המשטח. לאחר מספר הקשות הזבובים יפלו לתחתית ויהיו מדוהרי חושים למשך פרק זמן קצר מאוד זה. החלף במהירות את פלטת האגר הישנה בפלטה טרייה המצופה במשחת שמרים.השמרים מספקים תזונה לייצור ביצים, ויחד עם מיץ התפוחים באגר, הם מעודדים את הנחת הביצים. יש להשליך את הביצים שנאספו ב-30 עד 60 הדקות הראשונות. איסוף זה מניב חלק ניכר של עוברים בשלבים לא תואמים, מכיוון שהם הוחזקו על ידי הנקבות לאחר ההפריה.איספי ביצים עוקבים נוטים להיות נשלטים על ידי ביצים שהוטלו זמן קצר לאחר ההפריה. אספו ביצים למשך עד שלוש שעות, שכן השכיבה העקבית ביותר מושגת בעוברים צעירים. מועדפים זמני איסוף קצרים יותר של שעה אחת או פחות.עבור ניסויים שגרתיים, השתמשו בפינצטה כדי להסיר זבובים שנדבקו לשמרים או לפני השטח של צלחת האגר. לאחר איסוף הביצים, הסִירו את קליפת הביצה, הניחו את צלחת האגר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope) ובחנו את העוברים באמצעות תאורה נגדית (transillumination). ודאו שאתם מזהים את סיבי הביצה כדי להסיר את קליפת הביצה מהעוברים.התיזו bleach בריכוז 50% מתחת לצלחת האגר, כך שהעוברים יכוסו, והדגירו למשך מספר דקות. נערו את צלחת האגר מדי פעם כדי לסחרר את העוברים בתוך ה-bleach. בחנו שוב את הביצים תחת המיקרוסקופ.ברגע שסיבי הביצה אינם נראים יותר, ה-Corion הוסר בהצלחה. פעולה זו דורשת בדרך כלל שלוש עד חמש דקות של דגירה עם תמיסת האקונומיקה. לאחר מכן, השתמש בסלסילת רשתית כנפה כדי להפריד את העוברים מהאקונומיקה.הסלסלה מכינה מרשת מתכת שטוחה ריבועית בגודל שני סנטימטרים על שני סנטימטרים, עם שקע במרכזה. אחזו בסלסלת הרשת בעזרת פינצטה והחזיקו אותה מעל המכסה ההפוך של צלחת האגר. שפכו את תמיסת ההלבנה ומרקם העוברים מתוך צלחת האגר דרך רשת המתכת, כך שהנוזלים יטפטפו אל תוך מכסה צלחת האגר.אם נותרו עובריים על פלטת האגר, התיזו מים מזוקקים על הפלטה כדי לשחרר אותם, ושפכו את המים המזוקקים ואת תמיסת העובריים דרך רשת התיל.ספגו לעיתים קרובות נוזלים עודפים. חזרו על שלב השטיפה חמש עד 10 פעמים עד להסרה מלאה של המלבן. אם סלסילת התילים עדיין מפיצה ריח של מלבן, המשיכו לשטוף את העובריים.לאחר ששטפו את העוברים באופן מספיק, ניתן להצמידם באגרוז. שטפו את העוברים מתוך סלסילת התיל. כאשר משתמשים ב-TSS בתוך צלחת פטרי ריקה, העובר אמור לשקוע לתחתית.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, התבוננו בעובריו באמצעות תאורה בתחתית (trans illumination). ניתן לזהות בקלות שלבים ספציפיים באופן ויזואלי. בעזרת פיפט P 200, בחרו עוברי שלבים רצויים והעבירו אותם לצלחת אגר קטנה.עבדו במהירות מכיוון שהעוברים מזדקנים, וטבילה ממושכת ב-TSS למשך יותר מ-30 דקות עלולה להשפיע על ההתפתחות. בעזרת פטה, תחת נייר ניגוב מסוג Kim wipe, הסירו את רוב ה-TSS.פני השטח של האגר צריכים להיות לחים מעט, מה שמקל על הזזת העוברים. עם זאת, לא צריכות להישאר שלוליות של נוזל באף מקום על הצלחת, כיוון שנוזל עודף במהלך הצנטריפוגציה יגרום לעוברים להחליק החוצה מהחורים. ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו הוא קיבוע העוברים והמקדח (auger).משימה זו מאתגרת במיוחד מכיוון שהעובריים עדינים וניתן להרוסם בקלות או לטפל בהם בחוסר זהירות. כדי למנוע זאת, יש להזיז את המחט לאט, במכוון ובקידומים קטנים. תרגול הוא הדרך הטובה ביותר ללמוד בדיוק כמה מגע ולחץ העובר יכול לשאת. רכבו את הפינצטה והמחט הפוך במחזיק מחטים, כך שהקצה הקהה בולט בזמן התצפית.תחת המיקרוסקופ, השתמש במחט כדי ליצור חורים אנכיים באגר סביב כל עובר. כדי שניתן יהיה לצפות תחת המיקרוסקופ בו-זמנית עם יצירת החור באגר, המחט מוחזקת בזווית. לפיכך, קשה ליצור חורים שהם אנכיים באופן מוחלט. עם זאת, ההטיה הקלה של המחט יוצרת שקע או חריץ קטן בצדו של החור, כך שהעובר מחליק בקלות לאורכו אל תוך החור.בשלב הבא, זהו את הקצוות הקדמי והאחורי של העוברים המוארכים, שכן יש להחדיר את העובר אל החורים בכיוון עקבי. בדרך כלל, כאשר הקצה הקדמי פונה כלפי מעלה, קרום הביצה בקצה הקדמי מאופיין במבנה ייחודי. באמצעות הקצה הקהה של המחט, דחף בעדינות את העובר כדי להזיזו לאורך האגר, וכך כוון ותמרן את קציו האחורי לעבר חור ניקוב.לאחר מכן, דחפו את הקצה הקדמי לעבר החור. העובר אמור להחליק בקלות לתוך החור לאורך השקע הקל שנוצר במהלך הדקירה. ככל שהעובר נטיה למעלה, דחפו אותו עמוק יותר לתוך החור.האגר רך מספיק כך שברגע שעובר מוחדר באופן חלקי לחור שנוקב, ניתן לדחוף אותו פנימה עוד יותר מבלי לגרום לו נזק. כאשר הוא נדחף פנימה במלואו, העובר נמצא בדרך כלל כבר במצב אנכי למדי. אם לא, יש ליישר את העובר שהוחדר למצב אנכי יותר, תוך דחיפתו מצדדיו.אם החור אינו גדול מדי, מיקום העובר יישמר בצורה יציבה על ידי האגר לאורך כל תהליך הצנטריפוגה. עם תרגול, ניתן להטמיע בין 100 ל-250 עוברים לכל פלטה. מספר העוברים הדרוש תלוי ביישום הבא בתהליך.יש לשמור על זמן הרכבה קצר. מאחר שהעוברים ממשיכים להתפתח במהלך ההרכבה, במידה ונדרש שלב התפתחותי צר, יש להסיר עוברים שאינם בשימוש בעזרת מברשת זבובים לחה. לאחר מכן, העוברים המורכבים באגר עוברים לסנטריפוגה.העבירו את הצלחות המכילות את עוברי הזבובים לסלי המערבבים של הצנטריפוגה כאשר צד האגר פונה כלפי מטה. ודאו שהצנטריפוגה מאוזנת באופן אחיד וסובבו את הצלחות ב-4,000 סיבובים לדקה למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע עד 10 מעלות צלסיוס. לאחר הסבב בצנטריפוגה, הניחו את צלחת האגר תחת מיקרוסקופ דיסקסיה וכסו אותה בשכבה של TSS באמצעות הקצה הקהה של המחט.חפרו את העוברים מהחורים שלהם. העוברים צפים ב-TSS אך נותרים שקועים. העוברים נראים בעלי שכבות ברורות, עם כיסוי חום בקצה הקדמי, אזור מרכזי שקוף ואזור אפור כהה בקצה האחורי.יש להשליך עוברים שאינם מראים שכבה ברורה לצפייה ישירה במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) או במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence). השתמשו בפיפט P 200 כדי להעביר עוברים בעלי שכבות ברורות ב-TSS למבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, העבירו את העוברים שבבופר לסרטית זכוכית, ובצעו הרכבה (mount) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף.אם יש לקבע את העובריים, השתמשו בפיפטת P 200 כדי להעביר עובריים בשכבות ב-TSS לבקבוק סינטילציה. קבעו את העובריים באמצעות טכניקות קיבוע סטנדרטיות. זאת מכיוון שבעובריים שעברו צנטריפוגה, היעילות של שלב הדה-ויטליזציה (devitalization) נמוכה.התחילו עם מספר העוברים המרבי שניתן להשיג באופן מעשי. אם העוברים מיועדים לניסויי השתלה, העבירו אותם לצלחות אגר ומקמו על זכוכית כיסוי. השתמשו בנהלי טיפול סטנדרטיים בעוברים; הפניות לנהלים אלה ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב.השכבות הנוצרות כתוצאה מהצנטריפוגציה יציבות למשך עשרות דקות. כאן מוצגות תמונות באור בהיר של עוברים חיים של oph לפני הצנטריפוגציה, כאשר הקצה הקדמי פונה שמאלה והקצה האחורי פונה ימינה; הצד הגבי למעלה והצד הבטני למטה. עוברים בשלב הפילול נראים אחידים.שלבים חומים כגון אלה הם אידיאליים לצנטריפוגה in vivo. לעוברים בשלב ה-blaster derm יש שוליים שקופים הנראים דומים מכל הצדדים. פריפריה שקופה זו מתרחבת עד לסוף שלב ה-ization.ניתן עדיין לבצע שכיבה (stratification) מוצלחת של עוברים באמצעות סרצ'יפוגציה עד לסוף תהליך ה-ization. השכבה של החלמון והגרעינים אינה עקבית כבשלבי הפילול (cleavage). לאחר שהעוברים התאיים נראים אסימטריים, הצד הגבי (dorsal) והבטני (ventral) הופכים למובחנים ומתפתחים קיפולים שונים.העובר המוצג נמצא בשלב מוקדם של התארכות פס הנבטים. בשלבים אלו, סרטיפוגציה אינה יעילה יותר להפרדה לשכבות של האברונים העיקריים. embryogenesis הוא תהליך רציף.לפיכך, שלבים אלו אינם ישויות נפרדות, אלא הם הופכים זה לזה ככל שההתפתחות מתקדמת. סרט time lapse זה לוכד ארבע שעות של גוון עוברי החל משלבי הפילוח. הרחבת פס הנבטים מואצת פי 720.להלן תמונות של עוברי צנטריפוגה שצולמו באמצעות תאורה שבירה (trans illumination). העובר משמאל עבר ריבוי שכבות (stratification) בצורה טובה. טיפות השומן בעלות הצפיפות הנמוכה יוצרות כיפת שומן בקצה הקדמי ביותר.נשאי החלמון בעלי הצפיפות הגבוהה מצטברים כאזור אפור כהה בקצה האחורי. שני השכבות הללו מופרדות על ידי אזור שקוף רחב המייצג אברונים אחרים וציטופלזמה. העובר מימין עבר סנטריפוגה לאחר הפיסוק.השכבה היא מינימלית אם זמין מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיגנטי (epi fluorescence). ניתן לבחון עוברים חיים שעברו סנטריפוגציה תחת עירור UV, שבו החלמון מראה פלואורסצנציה כחולה עזה של המים. שכבה דחוסה של חומר אוטופלואורסצנטי בקוטב האחורי מעידה על סנטריפוגציה מוצלחת ומשמשת כסימן לקצה האחורי.מראה השכבות משתנה באופן דרסטי אם העוברים מקובעים. טיפות הליפידים הופכות לשקופות, ושכבת הליפידים נראית לבננה ופרוותית תחת מיקרוסקופיית אור בהיר, במקום חומה כהה. הפלואורסצנציה של Yo corso נהרסת באופן חלקי או מלא על ידי הקיבוע, והופכת להרבה פחות אינטנסיבית או אף לבלתי ניתנית לגילוי.בתמונה זו, אברונים מסומנים באמצעות סמנים פלואורסצנטיים, והסמנים מצטברים במיקומים אופייניים לאורך הציר הקדמי-אחורי. חלבוני חיבור של היסטונים מסוימים ממוקמים הן בטיפות ליפידים והן בגרעינים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לסמן מדורים תאיים אלו וכן כדי לנטר את שלב העובר על ידי מספר הגרעינים המסומנים. כפי שראיתם זה עתה, אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה הוא השקיעת העובריים לתוך המקדח.אך עם מעט תרגול, תוכלו לבצע זאת במהירות וביעילות. לאחר השליטה בשיטה, היא הופכת ניסויי קולוקליזציה (colocalization), שבדרך כלל הם מייגזים, לקלים מאוד.לדוגמה, המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו באופן שגרתי כדי לבחון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית האם חלבון מסוים ממוקם באבניב מרכזי ספציפי. בנוסף, ניתן להפיק שכבות בודדות מעוברים שעברו צנטריפוגה לצורך אנליזה ביוכימית או ניסויי השתלה. טכניקה זו אינה שימושית רק עבורוביו של זבוב הפירות.סנטריפוגציה מפרידה אף היא אברונים לפי צפיפות בביצים של מינים אחרים ובסוגי תאים גדולים אחרים, כגון cytes.

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תאים ראשוניים ניתק...

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin...

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למד הפרדת אורגנלות לפי צפיפות בעוברי Drosophila חיים באמצעות צנטריפוגה. שיטה זו מאפשרת ניסויים קולוקליזציה וניתוח ביוכימי ללא שבירת תאים ומזעור ארטיפקטים.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

גלה סרטונים נוספים