המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעמיס ננו-ספירות (Nanospheres) על מיקרוטובוליים, הגולשים על פני שטח המצופה בחלבוני קינזין (kinesin) מניעים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ציפוי פני השטח של תא זרימה מזכוכית בתמיסת קזאין. השלב השני של הפרוצדורה הוא ספיחה של חלבוני קינזין מניעים על פני השטח של תא הזרימה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת המיקרוטובוליים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הוספת מולקולות strept haver, אשר ייקשרו למיקרוטובוליים, ולאחר מכן הוספת הננוספירות. הננוספירות נקשרות למשטח תא הזרימה, שם הן עשויות להיספג על ידי המיקרוטובוליים.

בסופו של דבר, ניתן להבחין כיצד ננו-ספירות נקלטות על ידי מיקרוטובוליים ומוסעות על פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני אליין ג'ן סמית' מהמעבדה של ד"ר הנרי הס וממחלקת למדע והנדסת חומרים באוניברסיטת פלורידה. היום נדגים לכם פרוצדורה לבדיקת ניידות הפוכה (inverted motility assay).

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור טעינה של מטענים על מיקרוטובוליים ותנועה של מעבורות מולקולריות. אז בואו נתחיל. לפני תחילת ההליך, הכינו טריים את כל תמיסאות הסטוק כפי שמתואר בחלק הכתוב של סרטון זה.

לאחר הכנת תמיסות המלאי, התחל בהכנת המיקרו-טובולין על ידי פיפוט של 25 µL מתמיסת הצמיחה לתוך מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.65 mL. לאחר מכן, הוסף 6.25 µL מתמיסת הצמיחה ל-20 µg של טובולין ביוטיניליזציה ליופיליז). ערבב את התמיסה במכשיר וורטקס והנח אותה במסחם תרמי בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לצורך פולימריזציה. לאחר הדגירה, מהלל את התמיסה בדילול של 100 פעמים בבופר Taxol וערבב בעדינות בוורטקס.

תמיסה זו משמשת לייצוב המיקרוטובוליים. סמנו את התמיסה כ-MT 100 ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דילול של פי 10 של MT 100 בבופר anti fade וסמנו תמיסה זו כ-MT 1000.

לאחר מכן, הכין את מנועי ה-Kinesin על ידי דילול של תמיסתו של ה-kinesin פי 20 ב-TP buffer. סמן את התמיסה כ-kinase in 20 ושמור אותה על קרח. לבסוף, הכן את תמיסאות ה-streptavidin וה-nanosphere.

ראשית, הוסיפו streptavidin המסומן ב-Alexa Fluor 5 6 8 בריכוז של 100 nano molars בתוך Antifa Buffer. סמנו את התמיסה כ-STV 100, ולאחר מכן דללו nanospheres פי 5,000 ב-Antifa Buffer וסמנו תערובת זו כ-NS 5, 000. אחסנו את שתי התמיסות הללו על קרח.

לאחר הכנת התמיסות עבור בדיקת טעינת המטען (cargo loading assay), הכינו תא זרימה באמצעות זכוכית כיסוי וזכוכית כיסוי דקה (cover slip) המופרדות על ידי סרט דביק דו-צדדי. ראשית, הדביקו שני רצועות של סרט דביק דו-צדדי בשולי זכוכית הכיסוי, תוך השארת מרווח של כסנטימטר אחד בין הרצועות. לאחר מכן, הניחו את זכוכית הכיסוי הדקה מעל לסרט.

הפעל לחץ על לבישת הכיסוי באמצעות הקצה השטוח של פינצטה כדי ליצור אטימה. תא הזרימה שהוקם הוא באורך של כשני סנטימטרים, ברוחב של סנטימטר אחד ובגובה של 100 מיקרון, ונפחו הוא כ-20 מיקרוליטר. כדי להתחיל בהרכבת הבדיקה ההפוכה.

מקם את קצה הפ pipette בין זכוכית הכיסוי לבין הפלטה. לאחר מכן, הזרק 0.5 milligrams per milliliter של תמיסת casein אל תוך תא הזרימה. ציפוי זה של תא הזרימה יאפשר לקינזין לשמור על תפקודו לאחר הספיגה.

המתינו חמש דקות עד שפתרון הקזאין יכסה את השטח. לאחר מכן, ספחו Kinesin אל תא הזרימה על ידי הזרקת תמיסות קינאז ב-20; תמיסות מוכנסות לתאי הזרימה על ידי הנחת קצה הפ pipette בין זכוכית הכיסוי לבין הפסלודה. לאחר מכן, הפתרון מוזרק אל תא הזרימה מצד אחד, בעודו נספג בו-זמנית מהצד השני.

בעזרת נייר סינון, המתינו חמש דקות לספיגת ה-kinase in. לאחר מכן, הכניסו את המיקרוטובוליים לתא הזרימה על ידי פפיט של תמיסת ה-MT 1000 לתוך תא הזרימה. המתינו חמש דקות להתשקעות המיקרוטובוליים ולהיקשרותם למנועי ה-kinase in, לאחר היצמדות המיקרוטובוליים למנועי ה-kinase in.

צפו את המיקרוטובולי ב-strep TTR פלואורסצנטי על ידי הזרקת תמיסת STV 100 לתא הזרימה. המתינו חמש דקות כדי לאפשר למולקולות strep TTR להיקשר למיקרוטובולי. שטפו את עודפי ה-strep TTR על ידי הזרקת שלושה שטיפות של 30 µL מתמיסת Antifa לתא הזרימה.

לבסוף, הכניסו את ננו-ספירות הפלואורסצאין מפוליסטירן הביוטיניליות על ידי פפיטה של תמיסת NS 5,000 אל תוך תא הזרימה. הפני השטח סופחים באופן סטציונרי. ננו-ספירות יתנגשו עם המיקרוטובוליים הנעים וייקשרו אליהם.

בניסוי זה נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה מסוג eclipse TE 2000 U המצויד בעדשת אובייקטיב 100 x עם שמן, X site, נורת one 20 ומצלמת exon E-M-C-C-D. ראשית, יש להניח טיפה אחת של שמן טבילה על העדשה. לאחר מכן, יש להניח את תא הזרימה על בנמי המיקרוסקופ באמצעות קוביית המסננים trixy.

הביאו את המיקרוטובוליים לפוקוס, ולאחר מכן עברו לקוביית המסנן fitzy כדי לצפות בננוספרות. כעת, פתחו את תוכנת and or I exon והגדירו את מצב הרכישה לקינטי (kinetic). השתמשו בזמן חשיפה של 0.5 שניות, באורך סדרה קינטית של 20 ובזמן מחזור קינטי של שש שניות.

העבירו את המיקרוסקופ מעינית למצלמה והתחילו ברכישת תמונות. עבור ארבע התמונות הראשונות, השתמשו בקוביה ה-trixi כדי לדמות את המיקרוטובוליים. עבור 12 התמונות הבאות, עברו לקוביית המסנן של Fitz כדי לרכוש תמונות של הננוספירות.

לאחר מכן, חזרו לקוביות המסננים של ה-trixi. בארבע התמונות האחרונות להדמיית המיקרוטובוליים, המיקרוטובוליים נצפים באמצעות קוביות המסננים של ה-Trissy, כאשר קוביות המסננים הוחלפו ל-fite. כדי להמחיש את הננו-ספירות כאן, הננו-ספירות המובלות על ידי מיקרוטובוליים מסומנות בחצים. לא כל הננו-ספירות נאספו על ידי המיקרוטובוליים.

כעת מוצג מיקומן של הננו-ספירות 36 שניות מאוחר יותר, מה שמגלה כי הננו-ספירות השתפנו. כאשר המיקרוטובוליים מצולמים שוב, מתברר כי גם המיקרוטובוליים נעו לרוחב שדה הראייה. תמונות אלו מדגימות כי הננו-ספירות הועתקו כתוצאה מהסעה על ידי המיקרוטובוליים.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע את בדיקת הניידות ההפוכה (inverted motility assay). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחליף את קוביית המסננים (filter cubes) בזמן רכישת התמונות, כדי שניתן יהיה לראות הן את המיקרוטובוליים והן את הננו-ספירות. זהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.