Name: המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למדו כיצד להרכיב מערכת הסעה מולקולרית מבוססת מיקרוטובולים באמצעות חלבוני מנוע קינזין. השיטה מאפשרת העמסת ננוספירות ויישומים בננוטכנולוגיה ובביופיזיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה בכבדות אל יונתן הווארד, אשר פיתח את הקבוצה פרוטוקול בסיסי assay תנועתיות גלישה אשר הותאמה לאחר מכן על ידי בנו. תמיכה כספית מן NSF מענק DMR0645023 היא הודתה בהכרת תודה.

1.) Buffers ו ריאגנטים פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים מראש ומאוחסנים aliquots בגודל ובנוחות. Aliquot צריכה להכיל פתרון מספיק עבור ניסוי טיפוסי aliquot טרי אמור לשמש עבור כל assay תנועתיות. תנאי אחסון בגדלים aliquot טיפוסי מוזכרים גם הפרוטוקולים הבאים. 1. BRB80 חיץ, (80 צינורות מ"מ, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA ב deionized מזוקקים (dd) במים, pH 6.9 המותאמת ידי KOH) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא פתרון 100 מ"ל מניות של 0.5 M EGTA במים dd. התאם ל-pH 7.0 באמצעות פתרון 2 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא פתרון 100 מ"ל מניות של 1 M MgCl 2 במים dd. החיטוי את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 24.2 גרם של צינורות 3.1 גרם כדורי KOH ב כ 800 מ"ל מים ומערבבים dd לפזר. התאם את ה-pH 6.9 ל 1 באמצעות פתרון M KOH. הוסף 2 מ"ל של תמיסת 0.5 EGTA המניות M ו 1 מ"ל של 1 פתרון M 2 מניות MgCl. להעלות את נפח 1000 מ"ל עם מים dd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל בז ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש עתידי. צינור BRB80 כרגע בשימוש ניתן לאחסן 4 ° C או בטמפרטורת החדר. </li></ul> 2. מגנזיום כלוריד, MgCl 2 (100 מ"מ במים dd) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל במים dd להשיג הריכוז הסופי של mM 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי </li></ul> 3. Guanosine-5'-טריפוספט, disodium מלח, GTP (25 מ"מ dd המים, pH מותאם 7 על ידי NaOH) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים במים dd ולהתאים את pH עד 7 על ידי פתרון 2 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 11.7 x 103 ס"מ -1 מ -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 4. Sulfoxide דימתיל, DMSO <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 5. טקסול (1 מ"מ DMSO) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים DMSO מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 6. D-(+), גלוקוז, (2 מ 'במים dd) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים במים dd כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מ ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 7. גלוקוז אוקסידאז, (2 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס BRB80 להשיג ריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M ב dd מים) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמוססים במים dd מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 9. Catalase, (0.8 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס BRB80 לפחות 2 שלבים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ"ג / מ"ל. קבע את הריכוז בכל שלב על ידי מדידת ספיגת UV ב 276 nm ו 406 nm (השתמש מקדם הכחדה של 3.1 x 10 -5 מ -1 ס"מ -1 ב 276 ננומטר 2.2 x 10 -5 מ -1 ס"מ -1 ב 406 ננומטר המשוואה CL =). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 10. אדנוזין 5'-טריפוספט-, ה-ATP (100 מ"מ ב 100mm MgCl 2) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ MgCl 2 במים dd. לשקול את אבקה יבשה לפזר בפתרון זה המניה להשיג הריכוז הסופי של 100mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 15.4 x 10 ס"מ 3 -1 מ -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 11. פתרון קזאין (20 מ"ג / מ"ל ​​קזאין ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ 3 גרם קזאין למים 30 מ"ל ב dd צינור 50 בז מ"ל. וורטקס במשך שעה בערך 1 עד מפתחת פתרון עקביות עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g כ 15,000 עבור 30 דקות. סינון supernatant דרך 0.5 מיקרומטר ו 0.2 מזרק מסננים מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של supernatant על ​​ידי מדידת ספיגת UV ב 280 ננומטר (השתמש מקדם הכחדה של 0.67 ס"מ מ"ל -1 מ"ג -1). לדלל אותו 20 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) בעד 0.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 2.) תקן פתרונות אלה מוכנים ביום של הניסוי אמור להיות מושלך לאחר הניסוי נגמר. הכן 1 מ"ל של כל אחד. 1. BRB80CS0.5 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פתרון קזאין ב BRB80 לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן על קרח. פתרון זה הוא הציג לתוך התא זרימה לפני kinesin ומסייע לשמור על פעילות kinesin לאחר משטח ספיחה. </li></ul> 2. BRB80CA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.2 מ"ג / מ"ל ​​ו - קזאין 1 mM ATP ב BRB80 ולאחסן על קרח. Kinesin הוא מדולל יותר באמצעות פתרון זה לפני מבוא לתוך התא זרימה. </li></ul> 3. BRB80T <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פתרון טקסול ב BRB80 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לייצב microtubules. </li></ul> 4. BRB80CT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 טקסול מיקרומטר ו 0.2 מ"ג / מ"ל ​​קזאין ב BRB80 ולאחסן בטמפרטורת החדר. זה משמש יותר להכין את antifade ופתרונות microtubule. </li></ul> 5. BRB80AF <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ"מ D-גלוקוז, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​גלוקוז אוקסידאז, 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​Catalase, DTT 10 מ"מ, ו -20 מיקרומטר ATP ב BRB80CT ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לדלל streptavidin ו nanospheres ו "לשטוף" את streptavidin עודף בתא זרימה. מהירות kinesin יכול להיות נשלט על ידי התאמת ריכוז ה-ATP בפתרון זה. </li></ul> 3). Kinesin הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס kinesin מבנה המורכב של wild-type, באורך מלא, שרשרת תסיסנית kinesin melanogaster כבד C-מסוף תג שלו Escherichia coli ולטהר באמצעות טור Ni-נ.ת. ע כמתואר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את aliquots (10 μL כל אחת) ב 0.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. ריכוז kinesin פעיל aliquots אלה הוא כ 200 ננומטר. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי טיפוסי, לדלל את הפתרון kinesin 20 פי BRB80CA. תווית KIN20 פתרון ולאחסן על קרח. </li></ul> 4.) Microtubule הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 0.5 microcentrifuge מ"ל, להכין 25 μL של פתרון צמיחה: 4 מ"מ MgCl 2, 1 mM GTP ו DMSO 5% (v / v) במאגר BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.25 μL של פתרון זה aliquot 20 מיקרוגרם של טובולין biotinylated lyophilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , וורטקס אז מקום באמבט חום 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפלמר. מדולל 100 של פי BRB80T ו מערבולת בעדינות. תווית MT100 פתרון לאחסון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול של פי 10 MT100 ב BRB80AF. תווית MT1000 פתרון. </li></ul> 5.) Streptavidin ו Nanosphere פתרון הכן AlexaFluor568 שכותרתו streptavidin בריכוז של 100 ננומטר BRB80AF. לייבל זה STV100 ולאחסן על קרח. באופן דומה, לדלל nanospheres 5000 פי פתרון BRB80AF. לייבל זה NS5000 ולאחסן על קרח. 6). Cell תזרים בנייה לבנות flowcell באמצעות שני coverslips זכוכית מופרדות קלטת דו צדדית. זה התא זרימה הוא כ 2 ס"מ אורך, 1 ס"מ רוחב ו - 100 מיקרומטר גבוהה, יש נפח של כ 20 μL. פתרונות מוצגים לתוך התא זרימה מצד אחד באמצעות פיפטה והחוצה רשעים מן השני באמצעות נייר פילטר. 7). Assay הפוך האסיפה משטח זכוכית מצופה תחילה קזאין המאפשר kinesin לשמר את הפונקציונליות שלו על ספיחה. לאחר kinesin הוא adsorbed, microtubules מוצגים, אשר מוחזקות בידי kinesin. Microtubules הם מצופים אז עם streptavidin ניאון. אחרי כביסה את streptavidin עודף, biotinylated פוליסטירן והעמסת nanospheres (40 בקוטר ננומטר) הם הציגו. Adsorbed Surface nanospheres נייח להתנגש עם microtubules מרגש לקבל הועמסו על אותם (איור 1). סדר הזרימה של פתרונות זמן מותר לפני כניסתה של הפתרון הבא להלן. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80CS0.5, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KIN20, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MT1000, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STV100, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80AF, 3x </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NS5000 </li></ul> 8). מיקרוסקופית הר התא זרימה על הבמה מיקרוסקופ מיד לאחר הקדמה nanosphere. בניסוי זה, TE2000 U-Eclipse מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, מלוויל, ניו יורק) מצויד מטרה שמן 100x (NA 1.45), X-120 לצטט מנורה (EXFO, אונטריו, קנדה) ו EMCCD iXon המצלמה (אנדור, דרום וינדזור, CT) היה בשימוש. מסנן FITC קוביה (# 48001) ו קובייה TRITC מסנן (# 48002, Chroma טכנולוגיות, Rockingham, VT) שימשו nanospheres התמונה microtubules respectively על פני השטח התחתון של תאים הזרימה. זמן החשיפה היה 0.2s, ואילו הזמן בין החשיפה היה 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ציור סכמטי של המעבורות מולקולרית.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עם שינויים קלים, פרוטוקול זה שימש בהצלחה על ידי מגוון של קבוצות להרכיב kinesin-microtubule מבחני תנועתיות מבוסס. DTT 10 מ&quot;מ הפתרון הסופי תנועתיות יכול להיות מוחלף עם 0.5% β-mercaptoethanol. תקן פתרונות (BRB80AF, KIN20 ו MT1000) יותר מ 2 שעות הישן לא צריך להשתמש. כל פתרון המכיל microtubules טקסול ובמיוחד לא צריך להיות ממוקם על הקרח. חשיפת יתר של התא זרימה אל אור UV תוצאות עירור ב נזקי לרכיבים פונקציונליים:. Microtubules ו kinesin 8 השפעה זו מודגשת אף יותר אם התא זרי...

<table><tbody><tr><td>אדנוזין-5&amp;rsquo;-טריפוספט (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>טובולין עם ביוטין (Biotin tubulin)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>קזאין (Casein)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז (Catalase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותריטול (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינו&amp;#8211;אתילאתר)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-חומצה טטרא-אצטית (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-ספירות FluoSpheres עם ביוטין, 40 nm, פלואורסצנציה צהובה-ירוקה (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז (Glucose oxidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>גוואנוזין-5&amp;rsquo;-טריפוספט (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>פאקליטקסל (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-פיפרזינדיאתנסולפונית חומצה, פיפרזין-1,4-ביס(2-אתנסולפונית חומצה), פיפרזין-N,N&amp;#8242;-ביס(2-אתנסולפונית חומצה) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>אשלגנית (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>נתרנית (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטאווידין עם צימוד Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

המטען טוען על הסעות kinesin מולקולרית מופעל

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

תאים התפתחו מכונות מולקולריות מתוחכמות, כגון חלבונים kinesin המנוע חוטים microtubule, לתמוך תחבורה תאיים פעיל של המטען. בעוד kinesins זנב תחום נקשר מגוון רחב של מטענים, kinesins תחומים הראש לנצל את האנרגיה הכימית מאוחסנים מולקולות ATP לשלב יחד הסריג microtubule. ארוך, microtubules נוקשה לשמש להובלת מסלולים למרחקים ארוכים תאיים. מנועים אלה סיבים יכולים גם להיות מועסק בסביבות סינתטי microfabricated כרכיבים של המעבורות מולקולרית 1. בעיצוב נעשה שימוש תכוף, kinesin מנועים מעוגנים אל פני השטח את המסלול דרך הזנבות שלהם, microtubules פונקציונליות לשמש מרכיבים המטען שנשאו, אשר מונע על ידי מנועים אלה. בהסעות אלה ניתן לטעון עם מטען על ידי ניצול מחייב חזק סלקטיבית בין ביוטין ו streptavidin. מרכיבי מפתח (טובולין biotinylated, streptavidin, ומטענים biotinylated) זמינים מסחרית. בונים על assay תנועתיות הקלאסי הפוכה 2, בנייה של המעבורות מולקולרי מפורט כאן. Kinesin חלבוני מנוע הם adsorbed על משטח precoated עם קזאין; microtubules הם polymerized של טובולין biotinylated, דבק kinesin ומצופה לאחר מכן עם streptavidin-rhodamine שכותרתו. ריכוז ה-ATP נשמר ריכוז subsaturating להשיג מהירות microtubule גלישה אופטימלית עבור טעינת מטען 3. לבסוף, biotinylated והעמסת שכותרתו nanospheres מתווספים כמו מטען. Nanospheres לצרף microtubules כתוצאה מהתנגשויות בין microtubules גלישה ו nanospheres שמירה על פני השטח. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לטעון מגוון רחב של מטענים כגון DNA biotinylated 4, 5 נקודות קוונטיות או מגוון רחב של אנטיגנים באמצעות נוגדנים biotinylated 4-6.

ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

תאים פיתחו מנגנונים מולקולריים מתוחכמים, כגון חלבוני מנוע מסוג קינזין (kinesin) וסיבים של מיקרוטובוליים, כדי לתמוך בהובלה תוך-תאית פעילה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטעין ננו-ספירות (Nanospheres) על מיקרוטובוליים, הגולשים על פני שטח מצופה בחלבוני מנוע מסוג קינזין (kinesin). מטרה זו מושגת תחילה על ידי ציפוי פני השטח של תא זרימה מזכוכית בתמיסת קזאין. השלב השני של הפרוצדורה הוא ספיחה של חלבוני מנוע קינזין אל פני השטח של תא הזרימה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת המיקרוטובוליים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הוספת מולקולות strept haver, אשר ייקשרו למיקרוטובוליים, ולאחר מכן הוספת הננו-ספירות. הננו-ספירות נקשרות לפני השטח של תא הזרימה, שם הן עשויות להיסף על ידי המיקרוטובוליים.בסופו של דבר, ניתן להבחין כיצד ננו-ספירות נלכדות על ידי מיקרוטובוליים ומועברות לאורך פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני אליין ג'ן סמית' מהמעבדה של ד"ר הנרי הס ומחלקת מדעי החומרים והנדסה באוניברסיטת פלורידה. היום נדגים לכם פרוטוקול לבדיקת ניידות הפוכה (inverted motility assay).אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור טעינה של מטען על מיקרוטובולים ותנועה של מעביבים מולקולריים. אז בואו נתחיל. לפני תחילת נוהל זה, הכינו טריים את כל תמיסות המלאי כפי שמתואר בחלק הכתוב של סרטון זה.לאחר הכנת תמיסות המלאי, התחל בהכנת המיקרו-טובולין על ידי פיפטור של 25 µL מתמיסת הצמיחה לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.65 mL. לאחר מכן, הוסף 6.25 µL מתמיסת הצמיחה ל-20 µg של טובולין ביוטיניליזציוני ליאופיליז. ערבב את התמיסה ב-Vortex והנח אותה באמבט חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לצורך פולימריזציה. לאחר האינקובציה, דלל את התמיסה פי 100 בבופר Taxol וערבב בעדינות ב-Vortex.תמיסה זו משמשת לייצוב המיקרוטובוליים. סמנו את התמיסה כ-MT 100 ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דילול של פי עשרה של MT 100 בבופר anti-fade וסמנו תמיסה זו כ-MT 1000.לאחר מכן, הכינו את מנועי ה-Kinesin על ידי דילול של תמיסת ה-kinesin פי 20 בבאפר TP. סמנו את התמיסה כ-kinase in 20 ושמרו אותה על קרח. לבסוף, הכינו את תמיסות ה-streptavidin והננוספירות.ראשית, הוסיפו streptavidin מסומן ב-Alexa Fluor 5 6 8 לריכוז של 100 nano molars ב-Antifa Buffer. סמנו את התמיסה כ-STV 100, לאחר מכן דללו nanospheres פי 5, 000 ב-Antifa Buffer וסמנו תערובת זו כ-NS 5, 000. אחסנו את שתי התמיסות על קרח.לאחר הכנת התמיסות עבור בדיקת טעינת המטען, בנו תא זרימה באמצעות זכוכית כיסוי וזכוכית כיסוי דקה המופרדות על ידי סרט דבק דו-צדדי. ראשית, הדביקו שתי רצועות של סרט דבק דו-צדדי בקצוות של זכוכית הכיסוי, תוך השארת מרווח של כסנטימטר אחד בין הרצועות. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי דקה מעל הסרט.הפעל לחץ על ליתר הכיסוי באמצעות הקצה השטוח של פינצטה כדי ליצור איטום. תא הזרימה שהוקם הוא באורך של כשני סנטימטרים, ברוחב של סנטימטר אחד ובגובה של 100 מיקרון, ונפחו הוא כ-20 microliters. כדי להתחיל בהרכבת הבדיקה ההפוכה.הנח את קצה הפ pipette בין לביד הכיסוי לבין הזכוכית. לאחר מכן, הזרק 0.5 mg/mL של תמיסת casein אל תוך תא הזרימה. ציפוי זה של תא הזרימה יאפשר ל-kinesin לשמור על תפקודו עם הספיגה.המתינו חמש דקות עד שפתרון הקזאין יצפה את המשטח. לאחר מכן, ספחו Kinesin אל תא הזרימה על ידי הכנסת הפתרון; פתרונות מוכנסים לתאי הזרימה באמצעות הנחת קצה הפפיטה בין לביבת הזכוכית למשטח הזכוכית. לאחר מכן, מזריקים את הפתרון לתא הזרימה מצד אחד, בעודו נספג בו-זמנית מהצד השני.בעזרת נייר סינון, המתינו חמש דקות לספיגת ה-kinase in. לאחר מכן, הכניסו את המיקרוטובוליים לתא הזרימה (flow cell) על ידי פיפטור של תמיסת MT 1000 אל תוך תא הזרימה. המתינו חמש דקות לשקיעת המיקרוטובוליים ולהיצמדותם למנועי ה-kinase in, בעקבות היצמדות המיקרוטובוליים למנועי ה-kinase in.צפו את המיקרוטובוליים ב-strep TTR פלואורסצנטי על ידי הזרמת תמיסת STV 100 אל תוך תא הזרימה. המתינו חמש דקות כדי לאפשר למולקולות strep TTR להיקשר למיקרוטובוליים. שטפו את עודפי ה-strep TTR באמצעות שלוש שטיפות של 30 µL מתמיסת Antifa אל תוך תא הזרימה.לבסוף, הכניסו את ננו-ספירות הפלואורסצאין מפוליסטירן הביוטיניליות על ידי פיפטינג של תמיסת ה-NS 5,000 אל תוך תא הזרימה. השטח סופח וסטטי. ננו-ספירות יתנגשו עם המיקרוטובוליים הנעים וייקשרו אליהם.בניסוי זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה מסוג eclipse TE 2000 U המצויד בעדשת שמן 100x, ב-X site, בנורת 20 אחת ובמצלמת exon E-M-C-C-D. ראשית, יש להניח טיפה אחת של שמן טבילה על העדשה. לאחר מכן, התקן את תא הזרימה עלבמת המיקרוסקופ באמצעות קוביית המסננים trixy.הביאו את המיקרוטובוליים למצב פוקוס, ולאחר מכן עברו לקוביית המסננים של fitzy כדי לצפות בננו-ספירות. כעת, פתחו את תוכנת ה-and or I exon והגדירו את מצב הרכישה (acquisition mode) לקינטי. השתמשו בזמן חשיפה של 0.5 שניות, באורך סדרה קינטית של 20 ובזמן מחזור קינטי של שש שניות.העבירו את המיקרוסקופ מהעינית למצלמה והתחילו ברכישת תמונות. עבור ארבע התמונות הראשונות, השתמשו בקוביית trixi כדי לדמות את המיקרוטובוליים. עבור 12 התמונות הבאות, עברו לקוביית מסנן Fitz כדי לרכוש תמונות של הננוספירות.לאחר מכן, חזרו לקוביית המסננים trixi. עבור ארבע התמונות האחרונות שנועדו להדמיית המיקרוטובולים, המיקרוטובולים נצפים באמצעות קוביית המסננים Trissy, כאשר קוביית המסננים מוחלפת ל-fite. כדי להדמיז כאן את הננו-ספירות, הננו-ספירות המובלות על ידי מיקרוטובולים מסומנות באמצעות החצים. לא כל הננו-ספירות נאספו על ידי המיקרוטובולים.כעת מוצג מיקומם של הננו-ספירות לאחר 36 שניות, מה שחושף כי הננו-ספירות זזו. כאשר המיקרוטובוליים מצולמים שוב, ניכר כי גם הם נעו לרוחב שדה הראייה. תמונות אלו מדגימות כי הננו-ספירות הועתקו כתוצאה מהסעה של המיקרוטובוליים.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע את בדיקת הניידות ההפוכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחליף את קוביות המסנן בזמן רכישת התמונות, כדי שניתן יהיה לראות הן את המיקרוטובוליים והן את הננו-ספירות. זהו כל התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים.

זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מציגים את פרוטוקול לבנות מעבורות מולקולרית, היכן חלבונים מנוע קינזין דבקה משטח להניע microtubules צבען מתויג. אינטראקציות חלשות של kinesins עם המשטח מאפשר ההחזקה הפיך שלהם אליו. זה יוצר מערכת ננו אשר מוצגים דינמי הרכבה ופירוק של מרכיביו תוך שמירה על הפונקציונליות שלו.

הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

המטרה של פרוטוקול זה היא טופס הרכבים של מנועים מולקולריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים ולהתבונן ההרכב לתנועתיות באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.

אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

חדש במערכת במבחנה עבור טעינה בו זמנית four גידים בתרבות מתואר.

Ex vivo טוען מכני של גיד

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca 2 +-אינדיקטורים לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

למדו כיצד להרכיב מערכת הסעה מולקולרית מבוססת מיקרוטובולים באמצעות חלבוני מנוע קינזין. השיטה מאפשרת העמסת ננוספירות ויישומים בננוטכנולוגיה ובביופיזיקה.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

גלה סרטונים נוספים