יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

הגדל את קו התאים הרצוי כחד-שכבה דו-ממדית דבקה. הסירו את אמצעי התרבית ושטפו במי מלח חוצצי פוספט או PBS. לאחר מכן, מוסיפים טריפסין ודגרים בזמן שהתאים מתנתקים משטח הבקבוק והופכים לעגולים. הוסף מדיה טרייה כדי לנטרל את הטריפסין ולהשהות את התאים. מעבירים את התערובת לצינור חרוט, ומשתמשים בצנטריפוגה כדי להניע את התאים.

החלף את הסופרנאטנט במדיה טרייה והשהה מחדש את כדורית התא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור מספרי תאים ולחשב ריכוז עבודה. לאחר מכן, מעבירים את הכמות הנכונה של תערובת התאים לצלחת הדבקה עגולה ונמוכה במיוחד ודוגרים. התאים מתיישבים לתחתית ומצטברים. בסופו של דבר הם יתחברו זה לזה וייצרו מכלול תאים תלת-ממדי קומפקטי, הספרואידים.

בפרוטוקול לדוגמה, נראה כיצד ליצור ספרואידים תלת-ממדיים מקו תאים של סרטן המעי הגס, וכיצד הדמיה חיה מיושמת כדי לעקוב אחר היווצרותם. התחל על ידי שטיפת קו תאי סרטן המעי הגס עניין עם חמישה מיליליטר של PBS, והסרת התאים מתחתית הבקבוק עם 0.5 מיליליטר של טריפסין במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר אישור ניתוק תחת מיקרוסקופ, לנטרל את אנזים דיסוציאציה התא עם 10 מיליליטר של תווך שלם, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של תווך שלם טרי לספירה, והשהה מחדש את התאים בריכוז של 1.5 כפול 10 לתאים השלישיים למיליליטר.

לאחר מכן זרעו 20 מיקרוליטר של תאים בכל באר של צלחת עגולה בעלת 96 בארות, והניחו את הצלחת במנגנון הדמיה אוטומטי בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות. היכנס לתוכנת הרכישה של המנגנון, ובחר תזמון לרכישה, הפעל הוסף כלי, סרוק לפי לוח זמנים וצור כלי שיט, חדש. לאחר מכן, בחר סוג סריקה, Spheroid ובחר את ערוצי Brightfield ו- Fluorescence המתאימים של עניין. הגדר את ההגדלה ל- 10 פעמים ובחר את דגם הלוח ואת מיקומו בתוך מגירת מנגנון ההדמיה. בחר את מיקום הבארות לצילום והזן את תיאור הניסוי, כולל שם, סוג התאים ומספר התאים.

עבור הגדרת הניתוח, בחר דחה ניתוח עד מאוחר יותר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן, בחר קבע מרווח זמן נבחר של קבוצת סריקה והגדר הוסף סריקות כל ארבע שעות, ועבור סה"כ עד 24 שעות. לאחר מכן הגדר את זמן ההתחלה לפחות שעה לאחר הדגירה במנגנון ההדמיה האוטומטי. כדי לבדוק את התקדמות צמיחת הספרואידים, כל יומיים, היכנס לתוכנת ההדמיה ובחר הצג סריקות אחרונות. לחצו פעמיים על הניסוי המעניין ובחרו Brightfield בחלונית Image Channels. לאחר מכן השתמשו בכלי מדידת תכונות תמונה כדי למדוד את קוטר הספרואידים. הוספת 50 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר ביום הרביעי כדי להגביל כל מדיום של השפעות הופעה.