הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע שינויים יחסיים ברמות הטעינה של TRNA. מטרה זו מושגת על ידי בידוד RNA ב-pH נמוך לפני ואחרי טיפול, כדי לבודד TRNA עם רמות טעינה שלמות. כשלב שני, ה-RNA עובר טיפול בחמצון באמצעות פריודט, המאפשר קביעה של רמות הטעינה היחסיות.

לאחר מכן, חברו את הדגימות לאוליגונוקלאיד פלואורסצנטי והביאו להיברידיזציה על גבי מיקרו-מערך (microarray) כדי למדוד שינויים ברמות הליגציה כתוצאה מטעינת A-T-R-N-A. מתקבלים שינויים ברמה הגנומית של CHO בטעינת TRNA המבוססת על טכנולוגיית מיקרו-מערך של TRNA. שלום, אני ג'ון זאי מהמעבדה של ד"ר פאן במחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת שיקגו.

היום אדגים לכם פרוצדורה לבידוד ומדידה של tRNA טעון ברמה הגנומית. אנו משתמשים בשיטה זו כדי למדוד שינויים בטעינת ה-tRNA במהלך חשיפה לגורמי עקה במעבדה שלנו. אז בואו נתחיל.

כדי לבודד מטען כולל ל-TRNA, התחל בגידול של כמות שווה ללפחות 30 OD 600 של תאי שמרים, אשר אמורה להניב 30 מיקרוגרם של RNA כולל; שקע את התאים בצנטריפוגת שולחנית. השהה מחדש את התאים בתמיסת באפר ליזיס. הוסף נפח שווה של סודיום אצטט, פניל כלורופורם רווי וערבב ב-vortex למשך 30 שניות, ולאחר מכן הנח על קרח למשך 30 שניות לפחות.

חזרו על פעולות הערבוב במערבל (vortexing) והקיצוץ פעמיים נוספות. סובבו את הדגימה במצנטריפוגה ב-18,600 RFC למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסירו את השכבה המימית ובצעו מיצוי נוסף של פניל כלורפורם רווי אצטט לאחר המיצוי השני.

שקיע את ה-RNA על ידי הוספת 2.7 נפחים של אתנול וסבוב בצנטריפוגה ב-18,600 RFC למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את משקעי ה-RNA בתמיסת באפר ליזיס ולאחר מכן שקיע שוב עם אתנול פעם שנייה. לבסוף, השהה מחדש את ה-RNA בתמיסה המכילה 10 millimolar buffered acetate ו-one millimolar EDTA לצורך טיפול המשך.

ניתן לאחסן את הדגימה באופן יציב בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך כשבועיים נוספים. אחסון אינו מומלץ, כיוון שחלק מה-tRNA הטעון יתחיל להתפרק לפני הסימון באמצעות תגי oligonucleotides פלואורסצנטיים מסוג S3 או SCI 5. ה-tRNA הכולל עובר טיפול חמצון ב-periodate, המאפשר קביעה של רמות טעינה יחסיות; ערבבו את ה-RNA הכולל עם 0.066 µM של כל סטנדרט tRNA ו-100 mM של באפר אצטט בנוכחות 50 mM של sodium periodate. עבור דגימת בקרה של tRNA שלא תועבר חמצון, השתמשו ב-50 mM של sodium chloride במקום ב-sodium periodate.

דגרו את התגובות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר 30 דקות, עצרו את התגובה על ידי הוספת גלוקוז לריכוז של 100 millimolar ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר עצירת התגובה, בצעו החלפת בופר באמצעות עמודת ספין G 25 כדי להסיר שאריות של sodium prorate מהדגימות. שקיעו את הדגימות על ידי הוספת buffered acetate לריכוז סופי של 133 millimolar sodium chloride לריכוז סופי של 66 millimolar ו-2.7 נפחים של ethanol.

בשלב הבא, בודדו את דגימות ה-tRNA באמצעות Resus, על ידי השעייתן ב-50 millimolar tris HCL ודגירה ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, נטרלו את התגובה על ידי הוספת נפח שווה של 50 millimolar buffered acetate ו-100 millimolar sodium chloride, ובצעו שקיעה עם 2.7 x נפחים של ethanol. השעו שוב את משקע ה-RNA במים בריכוז של כ-one microgram per microliter.

לאחר שבדיקת איכות ה-RNA של דגימות הביקורת והדגימות המחומצנות בוצעה באמצעות הרצה על ג'לי אגרוז, ניתן להמשיך לסימון הפלואורסצנטי להצמדת תגי אוליגו פלואורסצנטיים ל-TRNA. ערבבו 0.1 µg/µL של RNA עם 4 µM של SI3 או SI5 המכילים אוליגנוקלאוטידים, באפר ליגז, 15% DMSO, 0.5 units/µL של T4 DNA ligase ו-yeast exo phosphatase; דגרו בטמפרטורה של 16 °C למשך למעלה מ-16 שעות. לאחר הליגציה, ערבבו את הדגימות עם ארבעה נפחים של אשלגן אצטט ואשלגן כלוריד, ולאחר מכן חלצו עם נפח שווה של פניל כלורוֹרם. לאחר חילוץ הפאזה המימית, שקיעו את תכשירי ה-RNA באמצעות אתנול. לבסוף, השעו את כדוריות ה-RNA במים בריכוז של כ-0.1 µg/µL לפני ההיברידיזציה; שטפו את שקופיות המיקרו-מערך (microarray slides) במים מזוקקים למשך אחת עד שתיים דקות כדי להסיר אוליגנוקלאוטידים שאינם קשורים.

בשלב הבא, ערבבו את חמש הדגימות המסומנות של S3 או SCI עם 140 µL של חוצץ היברידיזציה הכולל salmon sperm DNA בריכוז סופי של 140 µg/mL ו-poly A בריכוז סופי של 7 µg/mL. הריצו תוכנית היברידיזציה במכשיר היברידיזציה אוטומטי למערכים. אנו ממליצים מאוד להשתמש במכונת היברידיזציה אוטומטית עבור עבודות tRNA, כיוון שהיברידיזציה ידנית יוצרת רקע גבוה. עם השלמת תוכנית ההיברידיזציה, שטפו ידנית את השקופיות עם תמיסת שטיפה 3 (wash three solution) על ידי ניעור עדין בתוך מבחנה קונית של 50 mL למשך שלוש עד חמש דקות.

שטפו את השקופיות לפחות פעמיים בתוך מבחנות עטופות בנייר אלומיניום. ייבשו את השקופיות באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה למשך חמש עד 10 דקות לקבלת תוצאות מיטביות. יש לסרוק את השקופיות מיד לאחר ייבושן.

ניתן לסרוק את השקופיות פעמיים עד שלוש ללא ירידה ניכרת באיכות התמונה; תוצאות מייצגות של דגימת total RNA שהבודדה כהלכה והניתוח שלה מוצגות כאן. לדגימה זו ספקטרום נקי מאוד עם יחס OD 260 ל-OD 280 קרוב ל-2, ללא זיהום גלוי של חלבון או פנול בעת הרצה על ג'ל agarose בריכוז 1%.

אם דגימה חלשה באופן ניכר מדגימות אחרות, או אם נצפה מריחה (smearing), אין להשתמש בדגימות עבור מערכים זעירים (microarrays). למערכים זעירים צריך להיות רקע נמוך מאוד, הנמוך בסדר גודל מהגשש (probe) של ה-TRNA החלש ביותר. הרגע הדגמתי לכם כיצד לבודד ולקבוע את רמות הטעינה היחסיות של TRNA בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לזכור לשמור על ריאגנטים נקיים מנוקלאזות, במיוחד במהלך שלבי החמצון והדילול. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.