Name: הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו לנתח רמות טעינת tRNA ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מיקרו-מערכים. השיטה כוללת בידוד RNA, חמצון פריודט וסימון פלואורסצנטי לזיהוי שינויים בטעינת tRNA בתנאי מתח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העבודה שמרים במעבדה פאן מומן על ידי מענק מטעם Ajinomoto, Inc ביפן המכונים הלאומיים לבריאות הדרכה גרנט T32GM007183-33. אנו מודים ד&quot;ר רונלד Wek בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה לשיתוף פעולה לטווח ארוך על פרויקטים שמרים. כמו כן, אנו מבקשים להודות לד&quot;ר קימברלי Dittmar לפיתוח tRNA לחייב את שיטת microarray.

חלק 1: בידוד מוחלט של tRNA טעונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים בצנטריפוגה ליד השולחן RFC 2000 במשך 5 דקות. המקבילה של 1 OD 600 של תאים צריך לייצר לפחות 1μg של רנ&quot;א סך מינימלי של 30 מיקרוגרם מומלץ ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בפתרון חיץ תמוגה המורכב מ 0.3 שנאגרו Na +-אצטט (pH 4.5) ו 10 mM EDTA. וורטקס עם נפח שווה של Na +-אצטט רווי פנול / כלורופורם (pH 4.5) שלוש פעמים כל אחד במשך 30 s. הקפד תמיד לשמור על דגימות קרח בין vortexing. אצטט שנאגרו ניתן להכין מ NaOAC ו HOAc בעוד אצטט רווי פנול / כלורופורם יכול להיות מוכן על ידי ערבוב 1 חלק 5 מ שנאגרו אצטט (pH 4.5) עם 9 חלקים פנול / כלורופורם. הערה: סך בידוד RNA מתבצעת בתנאים חומציים במקצת על קרח, כדי למנוע deacylation של tRNA טעונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 18,600 RFC במשך 15 דקות 4 ° C. הסירו את השכבה המימית ולבצע מיצוי נוסף אצטט רווי פנול / כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החילוץ second לזרז את הרנ&quot;א על ​​ידי הוספת כמויות 2.7x של אתנול centrifuging ב 18,600 RFC במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כדורי רנ&quot;א פתרון חיץ תמוגה ולאחר מכן להאיץ עם אתנול בפעם השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend רנ&quot;א בתמיסה המכילה 10 אצטט mM שנאגרו (pH 4.5) ו 1 mM EDTA לטיפול הבאים. המדגם יכול להיות מאוחסן ביציבות כשבועיים ב -80 ° C. אחסון ארוך יותר אינו מומלץ כמו כמה tRNA טעונים יתחיל deacylate. </li></ol> חלק 2: הכנת תקנים tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים E. coli סטנדרטים tRNA ב מיקרומטר 10.5-85 ° C ב-pH 45 טריס-Cl mM 7.5 במשך 2 דקות. קחו את הצינור החוצה ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף MgCl 2 לריכוז סופי של 20 מ&quot;מ ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת התגובה synthetase כך התגובה הסופי מכיל 5 מיקרומטר tRNA, 60 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5), 12.5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM KCl, 3 מ&quot;מ dithiothreitol, 1.5 mM ATP, 1 mM spermine, 1 מ&quot;מ בהתאמה חומצת אמינו, ו - 4.2 יחידות / ה μl aminoacyl-tRNA coli synthetase לערבב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של אצטט M 0.5 שנאגרו (pH 4.5) ותמצית עם אצטט רווי פנול / CHCl 3 ב-pH 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את הסטנדרטים tRNA עם כרכים 2.7x של אתנול centrifuging ב 18,600 RFC במשך 30 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הסטנדרטים של אצטט 50 מ&quot;מ שנאגרו (pH 4.5) עם 1 mM EDTA ולאחסן ב -80 ° C עד חודש אחד. </li></ol> חלק 3: Cy3/Cy5 תיוג של tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם tRNA טעונים דגירה RNA סך בריכוז של 0.1 מיקרוגרם / μl עם 0.066 מיקרומטר E. כל coli tRNA תקנים (כלומר 0.67 pmole כל תקן לכל מיקרוגרם RNA סה&quot;כ) ו 100 אצטט mM בופר (pH 4.5) בנוכחות של 50 מ&quot;מ NaIO4 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשליטה המוחלטת להשתמש tRNA מדגם 50 mM NaCl במקום NaIO4. זכור לדלל את RNA רק עם פתרונות שנאגרו לשמור על הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרוות את התגובה להוסיף גלוקוז 100 מ&quot;מ ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר כל NaIO4 שנותרו מן המדגם לבצע חילופי חיץ באמצעות טור ספין G25. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לאזן את העמודה הראשונה על ידי הפעלת 200 שנאגרו mM אצטט חיץ (pH 4.5) דרך זה לפני החלת מדגם שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את המדגם על ידי הוספת אצטט שנאגרו (pH 4.5) לריכוז סופי של 133 מ&quot;מ ו NaCl לריכוז סופי של 66 mM ו כרכים 2.7x של אתנול. לעיתים משקעים שנייה עשוי להיות נחוץ עבור דגימות חמצון. זה נחוץ רק אם גלולה נראה שונה באופן משמעותי מזו של גלולה שליטה על מדגם זהה. לדוגמה גלולה באופן משמעותי יותר או מפוזר יותר. אם המשקעים אתנול השני הוא נדרש resuspend גלולה ב 50 pH אצטט חיץ mM 4.5 ו 200 mM NaCl לפני תוספת של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור deacylation הדגימות tRNA הם resuspended ב 50 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 9) וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. התגובה מנוטרלת על ידי תוספת של נפח שווה של אצטט 50 מ&quot;מ שנאגרו (pH 4.5) ו 100 mM NaCl. המשקע עם כרכים 2.7x של אתנול. לאחר משקעים, RNA הוא resuspended במים ב ~ 1 מיקרוגרם / μl. שניהם שולטים דגימות חמצון צריך לרוץ על ג&#39;לים agarose כדי לבדוק את איכות RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לצרף תגים אוליגו ניאון על גבי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl RNA deacylated הוא מודגרות במאגר האנזים 1x, DMSO 15%, 4 מיקרומטר Cy3 או Cy5 המכילים oligonucleotides, 0.5 יחידות / μl האנזים T4 DNA, ואת exo-phosphatase שמרים (5000 יחידות / μl) בשעה 16 ° C במשך הלילה (מעל 16 שעות). Exo-phosphatase הכרחי רק עבור דגימות שהתקבלו שמרים ניתן omitteד אם פרוטוקול זה משמש E. coli או דגימות אנושיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימות קשירת מעורבבים עם 4 כרכים של 50 מ&quot;מ KOAc (pH 7), 200 מ&quot;מ KCl, ולאחר מכן שלף עם נפח שווה של כלורופורם פנול /. לאחר מיצוי שלב מימית, ההכנות RNA הם זירז עם אתנול resuspended במים כ 0.1 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעילות קשירת ניתן להעריך על ידי הפעלת 5-10% של הדגימות על polyacrylamide ג&#39;ל המכיל 12% אוריאה 7m ו דמיינו עם סורק ג&#39;ל ניאון. ניתוח זה PAGE שימושית גם כדי לקבוע את כמות חמצון דגימות בקרה הדרושים הכלאה microarray. התוצאה קשירת טוב צריך להראות ~ 10% או יותר oligonucleotide Cy3/Cy5 המכיל להיות ligated כדי tRNA. לקבלת דוגמיות ביעילות תיוג טוב, בסך הכל 0.1-0.5 מיקרוגרם RNA לפי המדגם משמש הכלאה המערך. </li></ol> חלק 4: הכלאת ניתוח microarray <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שקופיות microarray הכלאה הם מבושלים במים מזוקקים במשך 1-2 דקות להסיר oligonucleotides מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cy3/Cy5 דגימות שכותרתו משולבים עם 140 μl של חיץ הכלאה והזרע DNA סלמון לריכוז סופי של 140 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו poly (A) לריכוז סופי של 70 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית הכלאה, (לוח 1), מנוהלת על hybridizer מערך אוטומטי. עבור עבודה tRNA, מומלץ מאוד כי מכונת הכלאה אוטומטית לשמש מאז הכלאה ידני מייצר רקע גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התוכנית היא להשלים באופן ידני לשטוף את השקופיות עם פתרון לשטוף 3 לפחות פעמיים על ידי בעדינות רועד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות יכול להיות מיובש על ידי centrifuging במהירות נמוכה, פחות מ 200 RFC, למשך 5-10 דקות. חשוב לשמור את השקופיות מתוך האור מאז החשיפה לאור לא להלבין את fluorophores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות הם יבשים הם צריכים להיות סרוקים מיד עבור תוצאות אופטימליות, במידת הצורך הם יכולים להישמר במשך כמה ימים במקום חשוך ויבש בטמפרטורת החדר. ניתן לסרוק שקופיות 2-3 פעמים ללא השפלה ניכר באיכות התמונה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג כאשר מבודדים כראוי המדגם הכולל RNA צריך לייצר ספקטרום מאוד נקי עם 260 OD: OD 280 יחס ליד 2. לא צריך להיות שום חלבון שניתן לזיהוי זיהום או פנול. מתי לרוץ על 1% agarose ג&#39;לים, להקה חזקה tRNA יש לשים לב אפשרי עם להקות אחרות חומצות גרעין שונות בין אורגניזמים. לאחר חמצון הלהקה נקי tRNA יש לשים לב. אם מדגם ניכרת חלשה יותר מדגמים אחרים או מריחות הוא ציין, דגימות לא אמור לשמש עבור microarrays. Microarrays צריך רקע נמוך מאוד שהוא בסדר גודל נמוך יותר מאשר לחקור את tRNA החלשה. הרקע העליון הוא בדרך כלל בגלל בעיות במהלך השלבים כביסה. בדרך כלל ניתן לתקן על ידי הכנת פתרונות טרי לשטוף ביסודיות את כל הציוד כביסה צינורות להסיר SDS שיורית ו זירז. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעד </td><td> פרטים </td></tr><tr><td> O-Ring מיזוג </td><td> 75 ° C, 2 דקות </td></tr><tr><td> הציגו את המדגם </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> לפגל לדוגמא </td><td> 90 ° C, 5 דקות </td></tr><tr><td> הכלאה </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> שטפי 1 </td><td> 50 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20 </td></tr><tr><td> לשטוף 2 </td><td> 42 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20 </td></tr><tr><td> לשטוף 3 </td><td> 42 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הכלאה פרוטוקול

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים שיטה בו זמנית לקבוע את רמות טעינה היחסי של כל tRNAs בקנה מידה גנומי. הפרוטוקול המובא כאן כבר אופטימיזציה עבור ס cerevisiae, והוא גם שימש בהצלחה למדוד פרופילים tRNA טעינה ב E. coli ו בתרביות תאים אנושיים. זה יכול להיות שונה כדי להכיל את כל אורגניזם עם רצפי גנום ידוע (המאפשר ביאור של כל הגנים tRNA) כל עוד tRNA טעונים בסך הכל ניתן להשיג.

<table><tbody><tr><td>עמודי Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור (EM)&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;פנילאלנין&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;טירוזין&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;ליזין&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; aminoacyl-tRNA synthetases</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>תחנת Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סורק GenePix 4000B</td><td>מכשירי Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>מכשירי Axon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות aminoacylation של trna שימוש microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

aminoacylation tRNA, או טעינה, רמות יכול לשנות במהירות בתוך תא בתגובה הסביבה [1]. שינויים tRNA לחייב רמות בתאים פרוקריוטים וגם הן אוקריוטים להוביל תקנה translational המהווה מנגנון הסלולר הגדולות של תגובת הלחץ. דוגמאות מוכרות הן תגובה מחמירים<em&gt; א coli</em&gt; ואת Gcn2 תגובת הלחץ מסלול בשמרים ([2-6]). עבודה אחרונים<em&gt; א coli</em&gt; ו<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; הראו דפוסי tRNA טעינה הם דינמיים מאוד תלוי בסוג הלחץ שחווים [1, 6, 7] תאים. דינמי מאוד, משתנה אופי של tRNA טעינה עושה את זה חיוני כדי לקבוע שינויים ברמות tRNA טעינה בקנה מידה גנומי, כדי להבהיר לחלוטין תגובה תאית לשינויים סביבתיים. בסקירה זו אנו מציגים שיטה בעת ובעונה אחת למדוד את רמות טעינה tRNAs היחסי של כל<em&gt; ס cerevisiae</em&gt;. בעוד פרוטוקול המובא כאן על השמרים, פרוטוקול זה יושם בהצלחה במגוון רחב של אורגניזמים כולל קביעת רמות טעינה יחסית<em&gt; א coli</em&gt; ותא התרבויות האנושיות [7, 8].

אנו מתארים שיטה לניתוח microarray לקבוע רמות aminoacylation היחסי של כל tRNAs מ<em&gt; ס cerivisiae.</em

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

רמות האמינואצילציה של tRNA, או טעינה (charging), עשויות להשתנות במהירות בתוך התא כמענה לסביבה[1]. שינויים ברמות הטעינה של tRNA הן ב...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע שינויים יחסיים ברמות הטעינה של TRNA. מטרה זו מושגת על ידי בידוד RNA ב-pH נמוך לפני ואחרי טיפול, כדי לבודד TRNA עם רמות טעינה שלמות. כשלב שני, ה-RNA עובר טיפול בחמצון באמצעות פריודט, המאפשר קביעה של רמות הטעינה היחסיות.לאחר מכן, חברו את הדגימות לאוליגונוקלאיד פלואורסצנטי והביאו להיברידיזציה על גבי מיקרו-מערך (microarray) כדי למדוד שינויים ברמות הליגציה כתוצאה מטעינת A-T-R-N-A. מתקבלים שינויים ברמה הגנומית של CHO בטעינת TRNA המבוססת על טכנולוגיית מיקרו-מערך של TRNA. שלום, אני ג'ון זאי מהמעבדה של ד"ר פאן במחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת שיקגו.היום אדגים לכם פרוצדורה לבידוד ומדידה של tRNA טעון ברמה הגנומית. אנו משתמשים בשיטה זו כדי למדוד שינויים בטעינת ה-tRNA במהלך חשיפה לגורמי עקה במעבדה שלנו. אז בואו נתחיל.כדי לבודד מטען כולל ל-TRNA, התחל בגידול של כמות שווה ללפחות 30 OD 600 של תאי שמרים, אשר אמורה להניב 30 מיקרוגרם של RNA כולל; שקע את התאים בצנטריפוגת שולחנית. השהה מחדש את התאים בתמיסת באפר ליזיס. הוסף נפח שווה של סודיום אצטט, פניל כלורופורם רווי וערבב ב-vortex למשך 30 שניות, ולאחר מכן הנח על קרח למשך 30 שניות לפחות.חזרו על פעולות הערבוב במערבל (vortexing) והקיצוץ פעמיים נוספות. סובבו את הדגימה במצנטריפוגה ב-18,600 RFC למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסירו את השכבה המימית ובצעו מיצוי נוסף של פניל כלורפורם רווי אצטט לאחר המיצוי השני.שקיע את ה-RNA על ידי הוספת 2.7 נפחים של אתנול וסבוב בצנטריפוגה ב-18,600 RFC למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את משקעי ה-RNA בתמיסת באפר ליזיס ולאחר מכן שקיע שוב עם אתנול פעם שנייה. לבסוף, השהה מחדש את ה-RNA בתמיסה המכילה 10 millimolar buffered acetate ו-one millimolar EDTA לצורך טיפול המשך.ניתן לאחסן את הדגימה באופן יציב בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך כשבועיים נוספים. אחסון אינו מומלץ, כיוון שחלק מה-tRNA הטעון יתחיל להתפרק לפני הסימון באמצעות תגי oligonucleotides פלואורסצנטיים מסוג S3 או SCI 5. ה-tRNA הכולל עובר טיפול חמצון ב-periodate, המאפשר קביעה של רמות טעינה יחסיות; ערבבו את ה-RNA הכולל עם 0.066 µM של כל סטנדרט tRNA ו-100 mM של באפר אצטט בנוכחות 50 mM של sodium periodate. עבור דגימת בקרה של tRNA שלא תועבר חמצון, השתמשו ב-50 mM של sodium chloride במקום ב-sodium periodate.דגרו את התגובות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר 30 דקות, עצרו את התגובה על ידי הוספת גלוקוז לריכוז של 100 millimolar ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר עצירת התגובה, בצעו החלפת בופר באמצעות עמודת ספין G 25 כדי להסיר שאריות של sodium prorate מהדגימות. שקיעו את הדגימות על ידי הוספת buffered acetate לריכוז סופי של 133 millimolar sodium chloride לריכוז סופי של 66 millimolar ו-2.7 נפחים של ethanol.בשלב הבא, בודדו את דגימות ה-tRNA באמצעות Resus, על ידי השעייתן ב-50 millimolar tris HCL ודגירה ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, נטרלו את התגובה על ידי הוספת נפח שווה של 50 millimolar buffered acetate ו-100 millimolar sodium chloride, ובצעו שקיעה עם 2.7 x נפחים של ethanol. השעו שוב את משקע ה-RNA במים בריכוז של כ-one microgram per microliter.לאחר שבדיקת איכות ה-RNA של דגימות הביקורת והדגימות המחומצנות בוצעה באמצעות הרצה על ג'לי אגרוז, ניתן להמשיך לסימון הפלואורסצנטי להצמדת תגי אוליגו פלואורסצנטיים ל-TRNA. ערבבו 0.1 µg/µL של RNA עם 4 µM של SI3 או SI5 המכילים אוליגנוקלאוטידים, באפר ליגז, 15% DMSO, 0.5 units/µL של T4 DNA ligase ו-yeast exo phosphatase; דגרו בטמפרטורה של 16 °C למשך למעלה מ-16 שעות. לאחר הליגציה, ערבבו את הדגימות עם ארבעה נפחים של אשלגן אצטט ואשלגן כלוריד, ולאחר מכן חלצו עם נפח שווה של פניל כלורוֹרם. לאחר חילוץ הפאזה המימית, שקיעו את תכשירי ה-RNA באמצעות אתנול. לבסוף, השעו את כדוריות ה-RNA במים בריכוז של כ-0.1 µg/µL לפני ההיברידיזציה; שטפו את שקופיות המיקרו-מערך (microarray slides) במים מזוקקים למשך אחת עד שתיים דקות כדי להסיר אוליגנוקלאוטידים שאינם קשורים.בשלב הבא, ערבבו את חמש הדגימות המסומנות של S3 או SCI עם 140 µL של חוצץ היברידיזציה הכולל salmon sperm DNA בריכוז סופי של 140 µg/mL ו-poly A בריכוז סופי של 7 µg/mL. הריצו תוכנית היברידיזציה במכשיר היברידיזציה אוטומטי למערכים. אנו ממליצים מאוד להשתמש במכונת היברידיזציה אוטומטית עבור עבודות tRNA, כיוון שהיברידיזציה ידנית יוצרת רקע גבוה. עם השלמת תוכנית ההיברידיזציה, שטפו ידנית את השקופיות עם תמיסת שטיפה 3 (wash three solution) על ידי ניעור עדין בתוך מבחנה קונית של 50 mL למשך שלוש עד חמש דקות.שטפו את השקופיות לפחות פעמיים בתוך מבחנות עטופות בנייר אלומיניום. ייבשו את השקופיות באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה למשך חמש עד 10 דקות לקבלת תוצאות מיטביות. יש לסרוק את השקופיות מיד לאחר ייבושן.ניתן לסרוק את השקופיות פעמיים עד שלוש ללא ירידה ניכרת באיכות התמונה; תוצאות מייצגות של דגימת total RNA שהבודדה כהלכה והניתוח שלה מוצגות כאן. לדגימה זו ספקטרום נקי מאוד עם יחס OD 260 ל-OD 280 קרוב ל-2, ללא זיהום גלוי של חלבון או פנול בעת הרצה על ג'ל agarose בריכוז 1%.אם דגימה חלשה באופן ניכר מדגימות אחרות, או אם נצפה מריחה (smearing), אין להשתמש בדגימות עבור מערכים זעירים (microarrays). למערכים זעירים צריך להיות רקע נמוך מאוד, הנמוך בסדר גודל מהגשש (probe) של ה-TRNA החלש ביותר. הרגע הדגמתי לכם כיצד לבודד ולקבוע את רמות הטעינה היחסיות של TRNA בעת ביצוע הליך זה.חשוב לזכור לשמור על ריאגנטים נקיים מנוקלאזות, במיוחד במהלך שלבי החמצון והדילול. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

genome-wide-analysis-aminoacylation-charging-levels-trna-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

מקור: סטנום, ט. ס. ואחרים. כימות השפע ורמות הטעינה של RNA מעביר באשרכיה קולי. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש באלקטרופורזה ג'ל ובלטינג צפוני לזיהוי והשוואת רמות הטעינה של RNA העברה ב-E. coli על ידי הפרדת צורות אמינואציליאטיות ודיאציליאטיות.

אלקטרופורזה ג'ל ו-Northern Blotting לזיהוי רמות טעינת tRNA ב-E. coli

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

למדו לנתח רמות טעינת tRNA ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מיקרו-מערכים. השיטה כוללת בידוד RNA, חמצון פריודט וסימון פלואורסצנטי לזיהוי שינויים בטעינת tRNA בתנאי מתח.

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

גלה סרטונים נוספים