הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס

כדי לחקור ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית קסנופוס, יש לשלב ביציבות תוצרי גנים משובטים בגנום. ראשית, גרעיני הזרע מבודדים מאשכי צפרדע בוגרים ופרם. לאחר מכן מכינים תמציות ציטוזוליות בין-פאזיות מביצי קסנופוס.

גרעיני הזרע ותמצית הביצית מעורבבים עם טרנסגני ליניארי, DNA ואנזים הגבלה. במהלך שלב זה, דקון תמצית הביציות מעבה את כרומטין הזרע בעוד אנזים ההגבלה מקדם אינטגרציה של הטרנסגן. לבסוף, הגרעינים המטופלים מועברים לביציות לא מופרות.

כל תא של העובר שנוצר נושא את הטרנסגן והביטוי התלוי במקדם של הטרנסגן מזוהה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית או שיטות אחרות. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות אחרות, כגון הזרקת DNA, הוא שהעוברים המתקבלים עוברים אינטגרציה של הטרנסגן לפני המחשוף הראשון. המשמעות היא שהעוברים המתקבלים אינם כימריים, ולכן אין צורך ברבייה.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור מספר רב של עוברים טרנסגניים במהירות וביעילות תוך שעות ספורות בלבד. ניתן להשתמש בעוברים טרנסגניים אלה לניתוח תפקוד המקדם או הגנים, או שניתן לגדל אותם ליצירת קווים טרנסגניים הצצה בהליך זה על ידי העברת האשכים של צפרדע אחת עד שתיים שהוקרבו לצלחת פטרי יבשה של 60 מילימטר. בעזרת מלקחיים יש להשרות את האשכים עד שאין גושים גלויים.

הוסף שני מיליליטר של מאגר הכנה גרעינית קרה או NPB למשרט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה להשפריץ דרך כארבעה עובי של בד גבינה למשפך, ולאסוף את המסנן בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן שוטפים את המנה בשמונה מיליליטר NPB ומסננים דרך בד הגבינה לתוך הצינור. תמיסה זו מכילה את הזרע בידיים כפפות.

סחטו את בד הגבינה כדי לאסוף את הצנטריפוגה הנוזלית שנותרה את הצינור למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הזרע לאחר הצנטריפוגה, לשפוך את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף שמונה מיליליטר NPB וצנר אותו למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את הגלולה. סובב שוב במהלך הסיבוב, הביא מיליליטר אחד של NPB לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לאחר הסיבוב, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של NPB והוסיפו 50 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר. ליין טרי לפרם. תערובת הזרע דוגרת בעדינות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של XMPB קר אחד עם 3% BSA לשפופרת. כדי לעצור את תגובת הליאן, סובב את הליו במקום הטיפול. גלולה צריכה להיראות מעט יותר שקופה ממה שנראתה קודם.

השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר NPB קר עם 0.3% BSA כדי לשטוף את גרעיני הזרע מעורבבים בעדינות עם פיפטה של 10 מיליליטר ולהסתובב כלפי מטה לאחר הסיבוב, לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה. ב-500 מיקרוליטר של מאגר אחסון זרע מעבירים את הזרע לצינור של 1.5 מיליליטר. זהו מלאי הגרעינים הנח את הצינור הזה על קרח כדי לבדוק את תפוקת הגרעינים.

הנח 98 מיקרוליטר של מאגר דילול זרע, מיקרוליטר אחד מהמלאי הגרעיני ומיקרוליטר אחד של דילול אחד עד 100 של מלאי האקס בצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. מערבבים היטב. באמצעות איש פיפט אפשר לכמות קטנה לזרום לתא של ציטומטר המו על ידי פעולה נימית.

תחת מיקרוסקופ מורכב, ספרו את הגרעינים. זכר אחד אמור להניב 50 עד 100 מיליון תאים. הנח את הגרעינים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לגליצרול לחדור לשימור טוב יותר בהקפאה.

חנקן נוזלי קפוא מאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס ביצי שטר שנאספו משמונה עד 12. צפרדעים מועברות לכוס ונשטפות ארבע פעמים בכ-35 מיליליטר של מאגר תמצית, ולאחר מכן פעמיים ב-25 מיליליטר של מאגר תמצית ציטוסטטי או C-S-F-X-B עם מעכבי פרוטאז כדי לארוז את הביצים, להעביר אותן לצינורות Beckman UltraClear. הניחו לביצים להתייצב.

הסר כמה שיותר C-S-F-X-B וצנטריפוגה ב-150 Gs למשך כ-60 שניות. לאחר הצנטריפוגה, הסר את התמיסה העודפת מהחלק העליון של הביצים הארוזות. לאחר מכן כדי לרסק את הביציות וליצור תמצית ציטופלזמית, צנטריפוגה את הביצים ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הביצים צריכות להיפרד לשלוש שכבות.

השכבה העליונה מורכבת משומנים. השכבה האמצעית היא ציטופלזמה, והשכבה התחתונה היא חלמון. הכנס מחט בגודל 18 עם מזרק מחובר דרך הצינור בבסיס השכבה האמצעית ומשוך את התמיסה הציטופלזמית.

העבירו את התמיסה לשפופרת UltraClear Beckman טרייה על קרח. הוסף מעכבי פרוטאז לציטופלזמה המבודדת לריכוז סופי של צנטריפוגה x אחת. התכשיר הציטופלזמי ב -16, 000 גרם למשך 10 דקות.

בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הציטופלזמה המובהרת לצינור חדש. צפו לקבל 0.75 עד מיליליטר אחד של ציטופלזמה לכל צפרדע. לאחר מכן, הוסף לדגימה 20 מנפח התמצית של תערובת האנרגיה.

העבירו את הציטופלזמה לצינורות פוליקרבונט בעלי קירות עבים. לאולטרה-צנטריפוגה, הוסף סידן כלורי מולרי אחד לכל צינור לריכוז סופי של 0.4. מילימולר דוגר על הצינורות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, זה מנטרל גורם ציטוסטטי ודוחף את התמצית לצנטריפוגה בין-פאזית.

באולטרה-צנטריפוגה ב-200,000 גרם למשך שעה וחצי בארבע מעלות צלזיוס, הציטופלזמה תתפצל לארבע שכבות מלמעלה למטה. הם שומנים, ציטוזול, ממברנה ומיטוכונדריה, וגליקוגן וריבוזומים. הכנס מזרק לחלק העליון של הצינור והסר את השכבה הציטוזולית.

זה צריך להיות בערך מיליליטר אחד. אם הועמסו שניים עד שלושה מיליליטר לתוך הצינור, העבירו את החלק הציטוזולי לצינורות טריים וצנטריפוגו את הדגימות ב-200,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והעבירו את הסופרנטנט ל-25 מיקרוליטר בצינורות של 0.5 מיליליטר. מקפיאים במהירות את האליקוטים בחנקן נוזלי ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

כדי להגדיר תגובת טרנסגנזה, השתמש בקצה פיפטה קצוץ כדי לערבב בעדינות את מלאי הגרעינים ולשלב ארבעה מיקרוליטרים של גרעינים ושני מיקרוליטרים של פלסמיד ליניארי בצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהדגירה נמשכת. מדללים 0.5 מיקרוליטר מאנזים ההגבלה ב -4.5 מיקרוליטר מים.

לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים מדולל ל-18 מיקרוליטר של מאגר דילול זרע, שני מיקרוליטר מגנזיום כלוריד ושני מיקרוליטר של תמצית במהירות גבוהה. הוסף תערובת זו לתגובת הפלסמיד של הגרעין. דגירה של 10 דקות נוספות כדי לנפח את הגרעינים במהלך הדגירה הזו.

ביצים המתקבלות משתיים עד שלוש נקבות צפרדעים נשטפות ונשטפות חמש פעמים ב-XMMR אחד. השתמש בפיפטה רחבה של חזיר כדי להעביר 400 עד 500 ביצי שטר לכל אגרוס. צלחת באר המכילה 0.2 XMMR ו-4%fi.

התקשר כ-15 עד 20 דקות לאחר תחילת תגובת הטרנסגנזה. מערבבים בעדינות את הגרעינים, מחלצים תגובת DNA עם קצה קצוץ EC ומוסיפים חמישה מיקרוליטרים של התגובה ל-150 מיקרוליטר של מאגר דילול זרע בטמפרטורת החדר כדי לטעון את המחט בחזרה. הנח חתיכת TIG עדין על הצינור על קצה קצה הפיפטה הקצוץ EC בנפח 200 מיקרוליטר.

צייר את הפתרון. לאחר מכן חבר את הצינור למחט ואפשר לתמיסה להיכנס למחט על ידי כוח הכבידה. חבר את המחט לצינור המשאבה.

מניחים את הביצים על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן הכנס במהירות את המחט לביצה הראשונה. ההזרקה צריכה להיות רדודה ובניצב בערך לקרום הפלזמה X.

כדי למנוע נזק, שמור את המחט בביצה למשך כ- 0.5 שניות. בחלוקה בקצב של כ-20 ננוליטר לשנייה, ניתן להשלים מנה אחת עד שתיים של השתלות תוך 20 עד 30 דקות. לאחר הזריקות, הניחו את הכלים בטמפרטורה של 16 עד 20 מעלות צלזיוס עד שהעוברים הגיעו לשלב של ארבעה עד שמונה תאים.

יש לגדל עוברים טרנסגניים הנובעים מהעברות גרעיניות עד שהביטוי של מקדם העניין נראה בתמונה המוצגת כאן. מקדם אקטין שריר מניע ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק בסומיטים של ראשן טרנסגני זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהעברה גרעינית של גרעיני זרע כדי ליצור עוברי אופוס טרנסגניים.

גישה זו הודגמה עבור טרנסגנזה עם אופוס לאביס, אך ניתן להתאים אותה גם לזאפ טרופי עם שינויים קלים.