Name: הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו שיטה ליצירת צפרדעים טרנסגניות Xenopus laevis באמצעות השתלת גרעיני זרע לביצים לא מופרות. הטכניקה מאפשרת חקר ביטוי גנים בהתפתחות עוברית ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון עבודתנו מסופק על ידי ה-NIH, מצעד הפרוטות, ואת האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן.

<ol><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li>
<li>Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li>
<li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling%3A+a+mechanism+for+lens+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li>
<li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li>
<li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li>
<li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה.

עבור כל אחד לבנות מהונדס להיבדק, אנחנו בדרך כלל השתלת גרעינים לתוך 500-1000 ביצים, בקנה המידה הזה, אנחנו יכולים ליצור עוברים מהונדס המבטא עד 10 מבנים שונים ליום, תלוי כמה נקבות רבות המושרה להטיל ביצים. של השתלות אלו, כשליש לדבוק ביצים 60-80% מהם עוברים דרך gastrulation ביקוע להמשיך כרגיל. בהתאם לתנאי התגובה המשמש, בין 10-50% של עוברים אלה מבטאים את transgene של עניין. לכן, לאחר הליך זה היא הוקמה בשנת במעבדה, זה אפשרי עבור עובד אחד כדי ליצור אוכלוסיות של עוברים מהונדס המבטא מספר פל...

גרעינים א זרע הכנה ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X MMR (2mm CaCl 2, HEPES 5mm, pH7.5, 2mm KCl, 1mm MgCl 2, NaCl 100mm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic חומצה אתיל אסתר, Sigma A-5040), סודיום ביקרבונט 0.1%. להתמוסס במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמאת 2X הכנה גרעיני (NPB). ביום הכנת הגרעינים זרע, לפצות 30 מ&quot;ל NPB 2X מ aliquots של פתרונות מניות מאוחסנים קפוא: סוכרוז 500 מ&quot;מ (1.5 המניות M), 30 HEPES מ&quot;מ (1M המניות; לכיל עם KOH כך pH 7.7 נמצא 15 מ&quot;מ), 1 spermidine mM trihydrochloride (Sigma S-2501: 10 מניות מ&quot;מ), 0.4 mM tetrahydrochloride spermine (Sigma S-1141: 10 מניות מ&quot;מ), 2 מ&quot;מ dithiothreitol (Sigma D-0632: 100 מניות מ&quot;מ), 2 מ&quot;מ EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2XNPB לעשות א 30 מ&quot;ל 1X NPB, ב 10 מ&quot;ל 1XNPB 3% BSA (חלק V, Sigma A-7906), כ 5 מ&quot;ל 1XNPB 0.3% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysolecithin: 100 μl של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-α-lyso, לציטין, חלמון ביצה (Calbiochem, 440,154); מתמוססים בטמפרטורת החדר לפני השימוש. חנות מניות מוצק בטמפרטורה של 20 ° C. מחק את אבקת המניות אם הוא הופך להיות דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שור בסרום אלבומין (BSA): 10% (w / v) BSA (חלק V, Sigma A-7906) מאפרים 5 מ&quot;ל מים ביום הכנת גרעיני זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון זרע חיץ (1ml) 1X NPB, גליצרול 30%, BSA 0.3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול חיץ זרע: סוכרוז 250 מ&quot;מ, 75 מ&quot;מ KCl, spermidine trihydrochloride 0.5 מ&quot;מ, 0.2 mM tetrahydrochloride spermine. לכיל ל-pH 7.3-7.5 ולאחסן aliquots 0.5-1 מ&quot;ל ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hoechst מס &#39;33342 (Sigma B-2261): 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל המניות DH 2 O, חנות כלי חזק אור ב 20 ° C. </li></ol> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלי הרוטור נדנוד צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה של כלים (מלקחיים ומספריים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפפות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hemocytometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים (26 מד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגבות נייר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (60 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pipettes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסטיק (5 ו - 10 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetman טיפים (1 מ&quot;ל ו 200μl) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים (1 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות (14 מ&quot;ל; פלקון, 2059) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microcentrifuge (1.5 מ&quot;ל) </li></ul> ב הכנת תמצית מהירות גבוהה ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X מארק השתנה Ringer (MMR): 100 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 2, 1 mM MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5. הכינו מלאי 10X, ולהתאים pH עם NaOH עד 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20X חלץ חיץ (XB) מניות מלח: 2 M KCl, 20 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית חיץ (XB, שזה עתה הוכנו מאוחסנים על הקרח): 1X XB מלחים, סוכרוז 50 מ&quot;מ, HEPES 10mm (1 מ &#39;מניות, עם KOH טיטרציה pH כך כי הוא 7.7 כאשר מדולל ל 15 מ&quot;מ; פילטר לעקר, ולאחסן aliquots בשעה 20 ° C). הכן על 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% (w / v) L-ציסטאין הידרוכלוריד 1-מימה: Made למעלה 1X מלחי XB לפני השימוש טיטרציה pH 7.8 עם NaOH. הכן על 300 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSF-XB: 1X מלחי XB, 1 mM MgCl 2 (בנוסף MgCl 2 המצויים מלחי XB; הריכוז הסופי 2 מ&quot;מ), 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.7, סוכרוז 50 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ EGTA, pH 7.7. הכן 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי פרוטאז: תערובת של leupeptin, chymostatin ו pepstatin, כל מומסים לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfoxide דימתיל (DMSO). אחסן aliquots קטן 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל אנרגיה: 150 mM קריאטין פוספט, 20 mM ATP, 20 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהריון Mare סרום גונדוטרופין (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021,825). מתמוססים במים ומאוחסנים בטמפרטורה של 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוריוני אנושי גונדוטרופין (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057,176). מתמוססים במים מאוחסנים 4 ° C. </li></ol> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Xenopus laevis נקבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים (18 ו - 26 מד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פסטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחב לשעמם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים (1 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, microcentrifuge (0.5 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, בעובי קיר פוליקרבונט (Beckman, 349,622) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, ultraclear (14 x 95 מ&quot;מ; Beckman, 344,060) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ו הרוטורים (למשל, Beckman TL-100 עם רוטורים SW 40 טי ו-TLA 100.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוסות איסוף ביצים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דליים או מיכלי לקיום צפרדעים הנשי (למשל, 4-L כוסות פלסטיק עם מכסים רשת). </li></ul> ג השתלה גרעינית. ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose 2.5% ב 0.1XMMR (להכנת מנות הזרקה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציסטאין 2.5% ב 1XMMR, PH8.0, שהוכן ביום להשתמש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin (מניות 1000x) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות גבוהה לחלץ ביצה (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MMR 10X (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזים (למשל NotI מניו אינגלנד Biolabs) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול זרע חיץ (sdb: ראה לעיל) גרעינים זרע (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) לעיל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן מינרלי (Sigma, M8410) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לינארית פלסמיד להיות הציג כמו transgene: הכן לינארית פלסמיד בריכוז של כ - 100 ng / μl ב סטרילי, nuclease ללא מים (אנו נמנעים טריס ו EDTA המכילים מאגרים, שהם רעילים מעט עוברים). אנזים הגבלה משמש linearize הפלסמיד אינו חייב להיות זהה לזה המשמש בתגובה העברת גרעיני. אנחנו בדרך כלל להשתמש NotI לתגובות כל, ולא משנה מה היא לינארית עם פלסמיד. חלק כיול של דילול האנזים המשמש התגובה עשוי להיות נחוץ, אנזים כמו יותר מדי יכול לגרום להשפעות שליליות על התפתחות שלאחר gastrula. פלסמיד יכול להיות מטוהרים במספר דרכים שונות: בדרך כלל אנו משתמשים Qiaquick Qiagen ערכת טיהור PCR על פי הנחיות היצרנים, טיהור של להקה אחת מן ג&#39;ל אינו הכרחי. אם הפלסמיד הוא מטוהרים באמצעות פנול / כלורופורם עקירות ומשקעים אתנול, להיות בטוח כדי להסיר את כל עקבות של חומרים אורגניים ואתנול. </li></ol> ציוד: מנות agarose להזרקה: ב 60 מ&quot;מ צלחת פטרי מפלסטיק, להניח 35mmX35mm קטן שוקל סירה על agarose 2.5% מותך 0.1XMMR מים כדי ליצור דיכאון עם תחתית agarose מצופה למילוי עם ביצים. לאחר agarose התקשה, עוטפים ומאחסנים parafilm ב 4 ° C עד השימוש. בצע 2-3 מנות מראש על כל תגובה מהונדס אתה מתכנן לעשות. משאבת עירוי: אנו משתמשים מזרק אחד אינפוזיה משאבה מ Apparatus הרווארד, מצויד מזרק 3 סמ&quot;ק / מחט מלא שמן מינרלי (Sigma M-8410). בלאנט את מחט המזרק קצה (כדי למנוע ממנו ניקוב בצינור) וכן לצרף את צינורות tygon בסדר. הפעל את המשאבה ב ~ 10nl/sec; זו מניחה כי זמן המחט היא כל ביצה לא יהיה גדול מ -1 שניות. משאבה צריך להיות מראש לרוץ במשך כמה דקות לפני transgenesis החל היום כדי להבטיח את הבוכנה של המזרק הוא מיושר עם בוכנה וכי תזרים חיובי יציב של שמן מתוך הצינור מתרחש. מחטים עבור העברות גרעיני. בעזרת חולץ micropipette, ליצור עם מחטים, טיפים ארוך משופע. תמונות אלה עם המלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח מצויד מיקרומטר עינית להשיג ~ 80 מיקרון הפתיחה עם צורה משופעים. ציוד נוסף: Xenopus laevis נקבות, stereomicroscope, חממה, micromanipulator, מחט microinjection חולץ (למשל דגם P-87, סאטר), מחטי מזרק (26 מד), microinjection מחטים זכוכית, מיקרומטר עינית מכויל עבור קטיעה של מחט טיפים microinjection לקוטר 80μm, בצלחות פטרי, לשקול סירות 35mm, צינורות Tygon (ID = 1 / 32 בו, OD = 3 / 32 אינץ&#39;)

הפקה של טראנסגנטי xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

שילוב יציב של מוצרים גן משובט לתוך הגנום Xenopus יש צורך לשלוט על הזמן והמקום של ביטוי, להביע את הגנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות העוברית, וכדי להגדיר כיצד משפרי ומקדמי לווסת התבטאות גנים בתוך העובר. פרוטוקול הפגינו כאן ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות מהונדס Xenopus laevis עוברים. גישה זו transgenesis כוללת שלושה חלקים: 1. גרעינים זרע מבודדים מבוגר X. laevis testis על ידי טיפול lysolecithin, אשר permeabilizes הממברנה הפלסמטית הזרע. 2. ביצה היא תמצית שהוכנה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, תוספת של סידן לגרום לחלץ להתקדם שלבי הביניים של מחזור התא, וכן צנטריפוגה במהירות גבוהה לבודד cytosol שלבי הביניים. 3. השתלת גרעיני: גרעין ותמצית בשילוב עם ה-DNA פלסמיד לינארית להיות הציג כמו transgene ואת כמות קטנה של אנזים הגבלה. במהלך התגובה קצר, לחלץ ביצה חלקית decondenses הכרומטין זרע האנזים הגבלה יוצרת הפסקות כרומוזומליות המקדמים של transgene רקומבינציה לתוך הגנום. גרעינים זרע שטופלו מושתלים מכן לתוך ביצים מופרית. שילוב של transgene מתרחשת בדרך כלל לפני המחשוף העוברית הראשונה כגון כי עוברי וכתוצאה מכך הם לא chimeric. עוברים אלו ניתן לנתח ללא כל צורך לגדל את הדור הבא, המאפשר לדור יעיל ומהיר של עוברים מהונדס עבור ניתוחים של האמרגן ותפקוד הגן. למבוגרים X. laevis הנובע הליך זה גם להפיץ את דרך transgene germline והוא יכול לשמש כדי ליצור שורות של חיות טרנסגניות למטרות מרובות.

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; על ידי הכנסת transgenes לתוך גרעין הזרע בעקבות השתלת גרעיני ביצים מופרית.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

שילוב יציב של תוצרי גנים משובטים בגנום של Xenopus נחוץ כדי לשלוט בזמן ובמיקום של הביטוי, כדי לבטא גנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות העוברית, וכדי להגדיר כיצד אלקמנטים מחזקים (enhancers) ומקדמים (promoters) מווסתים את ביטוי הגנים בתוך העובר. הפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש לייצור יעיל של עוברי Xenopus laevis טרנסגניים. גישה זו לטרנסגנזה כוללת שלושה חלקים: 1. גרעיני זרע מבודדים מאשכים של X. laevis בוגרים באמצעות טיפול בליזולציטין (lysolecithin), המגביר את חדירות קרום הפלזמה של הזרע. 2. תמצית ביצית מוכנה באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה, הוספת סידן כדי לגרום לתמצית להתקדם לשלב האינטרפאזה של מחזור התא, וסנטריפוגיה במהירות גבוהה לבידוד ציטוזול של האינטרפאזה. 3. השתלת גרעין: הגרעינים והתמצית משולבים עם DNA פלסמי ליניארי המיועד להחדרה כטרנסגן וכמות קטנה של אנזים רסטריקציה. במהלך תגובה קצרה, תמצית הביצית גורמת לדקונדנסציה חלקית של כרומטין הזרע, ואנזים הרסטריקציה יוצר שברים כרומוזומליים המקדמים רקומבינציה של הטרנסגן אל תוך הגנום. גרעיני הזרע המטופלים מושתלים לאחר מכן לתוך ביציות שאינן מופרות. שילוב הטרנסגן מתרחש בדרך כלל לפני ההחלקות העובריות הראשונות, כך שהעוברים שמתקבלים אינם כימריים. ניתן לנתח עובריים אלה ללא צורך בהרביה לדור הבא, מה שמאפשר יצירה יעילה ומהירה של עוברי טרנסגנים לניתוחי תפקוד של מקדמים וגנים. פרטי X. laevis בוגרים המתקבלים מההליך הזה מעבירים את הטרנסגן גם דרך תאי הנבט ויכולים לשמש ליצירת קווי בעלי חיים טרנסגניים למטרות מרובות.

כדי לחקור ביטוי גנים במהלך ההתפתחות העוברית של Xenopus, יש לשלב באופן יציב מוצרי גנים משוכפלים בגנום. ראשית, מבודדים גרעיני זרע מאשכים של צפרדעים בוגרות ומבצעים להם פרמיליזציה. לאחר מכן, מכינים תמרירי ציטוזול בשלב האינטרפאזה מביצי Xenopus.גרעיני הזרע ותמצית הביצית מעורבבים עם DNA טרנסגני ליניארי ואנזים הגבלה. במהלך שלב זה, תמצית הביצית גורמת לדקומדנסציה (דה-קומפרסיה) של כרומטין הזרע, בעוד שאנזים ההגבלה מקדם את השילוב של הטרנסגן. לבסוף, הגרעינים שעובדו מועברים לתוך ביציות לא הופריות.כל תא של העובר המתקבל נושא את הגן המעובל, וביטוי של הגן התלוי בקידומת (promoter) מזוהה באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה או שיטות אחרות. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות אחרות, כגון הזרקת DNA, הוא שהעוברים המתקבלים עוברים אינטגרציה של הגן המעובל לפני השסע הראשון. המשמעות היא שהעוברים המתקבלים אינם כימריים, ולכן אין צורך בהכלאה.באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור מספר רב של עוברים טרנסגניים במהירות וביעילות תוך מספר שעות בלבד. ניתן להשתמש בעוברים טרנסגניים אלו לניתוח תפקוד של פרומוטור או גן, או להרביעם ליצירת קווי טרנסגניים. התחלו בהליך זה על ידי העברת אשכים של צפרדע אחת או שתיים שהורגו לצ그러ת פטרי יבשה בקוטר 60 מילימטר.הוסיפו שני milliliters של בופר להכנת גרעינים קר, או NPB, לתערובת הדחוסה ושאיבב

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרכבה קרום הגרעין היא צעד חיוני במחזור חלוקת התא, תהליך זה יכול להיות משוכפל במבחנה על ידי שילוב של הכרומטין Xenopus זרע, cytosol, וכן שברים קרום אור. גרעינים השלם נוצרים, כולל ממברנות הגרעין עם מתחמי הנקבובית, ואלה גרעינים מחדש מסוגלים תהליכים גרעיניים רגילים.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

למדו שיטה ליצירת צפרדעים טרנסגניות Xenopus laevis באמצעות השתלת גרעיני זרע לביצים לא מופרות. הטכניקה מאפשרת חקר ביטוי גנים בהתפתחות עוברית ביעילות גבוהה.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

גלה סרטונים נוספים