פיצוח הקפאה של נמטודות: שיטה לחשיפת רקמות תולעים פנימיות להכתמה

- מעבירים C. elegans שטופים בנוזל על מגלשת זכוכית שצופתה בעבר בפולי-ליזין, תרכובת שתסייע לקוטיקולה של תולעת להידבק למשטח הזכוכית. לחץ בעדינות על שקופית זכוכית נוספת ישר למטה עם קצה מעל השקופית התחתונה. כדי לשתק את התולעים ללא נזק, לדחוס את החיות הימנעות כל תנועות לרוחב. לאחר מכן, הניחו את מגלשות הזכוכית עם תולעים דחוקות על גוש מתכת בתוך מיכל מעבדה מבודד מלא בחומר הקפאה, כגון חנקן נוזלי או קרח יבש.

מתכת היא מוליך טמפרטורה יעיל המבטיח שמשטח הבלוק קר מספיק כדי להקפיא במהירות את הקוטיקולה של התולעת לשני משטחי הזכוכית. לאחר ההקפאה, הפרידו במהירות את מגלשות הזכוכית כדי לפרק או לפתוח את ציפורני התולעת. המשך עם קיבוע רקמות והכתמה מכיוון שהפרעה בקוטיקולה בעלת החדירות הנמוכה מאפשרת לקיבוע כימי ונוגדנים מכתימים לגשת לרקמות התולעת הפנימיות. בפרוטוקול הבא נראה הדגמה מפורטת של טכניקת פיצוח ההקפאה וקיבוע רקמות.

- ראשית, הכינו שקופית לתיקון התולעים. פיפטה 30 מיקרוליטר של פולי-L-ליזין על שקופית, ולאחר מכן, להגדיר שקופית שנייה על השני ולשפשף אותם יחד כדי לפזר את התמיסה באופן שווה על שניהם. כעת, קלפו את שתי המגלשות ותנו להן להתייבש באוויר במשך 30 דקות.

לאחר מכן, מניחים גוש מתכת שטוח במיכל מלא בחנקן נוזלי. לשטוף את הצלחות עם פתרון M9 ולהעביר כ 10 מיקרוליטר של M9 המכיל את התולעים. לחלופין, בחר את התולעים והוסף M9 לשקופית.

לאחר העברת התולעים, שחררו עליהן בעדינות מעבר חצייה כך שהכיסוי יהיה תלוי על קצה אחד. לאחר מכן, לחץ בעדינות על הכיסוי מבלי לבצע תנועות רוחביות.

עכשיו, מיד להעביר את המגלשה בלוק מתכת בחנקן נוזלי ולתת לו להקפיא. לאחר חמש דקות, הסר את הכיסוי באמצעות הקצה התלוי. עשו זאת במהירות כדי לקבל את הסדק הנכון של הקוטיקולה.

לאחר מכן, טובלים את המגלשה בצנצנת קופלין מזכוכית מלאה מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, מעבירים את המגלשה לצנצנת קופלין מזכוכית מלאה באצטון למשך חמש דקות נוספות באותה טמפרטורה. ניתן להכתים את המגלשות ישירות או לאחסן אותן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.