PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

- לניתוח PCR של תולעת יחידה, יש לאפשר לתולעת הרמפרודיטית להפרות את עצמה ולהטיל ביצים שיולידו צאצאים זהים גנטית ולכן, לשמר עותק של הזן המעובד. לאחר מכן, העבר את ההורה לצינור המכיל חיץ ליזה תולעת.

מקפיאים את הצינור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לפתוח את הקוטיקולה או את השכבה החיצונית. חממו את הדגימה לטמפרטורה של פלוס 60 מעלות צלזיוס כדי לשכב את תאי התולעת, ושחררו את החלבונים התוך-תאיים יחד עם הדנ"א הגנומי של התא. בטמפרטורה זו, פרוטאינאז K בתוך המאגר מפרק את החלבונים, במיוחד נוקלאזות שאחרת היו הורסים את הדנ"א הגנומי.

לאחר מכן, להעלות את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס כדי להשבית את האנזים. לבסוף, הוסף את התא ליזט לצינור עם תערובת מאסטר PCR המורכבת ממאגר תגובה, dNTPs, פריימרים קדימה ואחורה לאזור העניין, פולימראז taq ומים המביאים את התגובה לנפח הסופי הרצוי. כדי לבצע את ה- PCR, הפעל את תוכנית המחזור התרמי המתאימה המגבירה את אזור ה- DNA המעניין.

בדוגמה הבאה, נראה הליך PCR לסינון אירועי עריכה של CRISPR-Cas9 בדנ"א הגנומי של תולעי F1 בודדות.

- לאחר יום עד יומיים של הטלת ביצים, השתמש בתמונת תולעת כדי להעביר את F1s לתוך כובעי צינור רצועת PCR בודדים המכילים 7 מיקרוליטר של חיץ ליזה חם. צנטריפוגו את צינורות ה-PCR במהירות מקסימלית ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי להביא את בעלי החיים לתחתית הצינור. לאחר מכן, להקפיא את צינורות שלילי 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לאחר מכן, ליז תולעים קפואות במחזור תרמי באמצעות התוכנית הבאה. לאחר מכן, הגדר תערובת מאסטר PCR כפי שמוצג בטבלה זו.

הוסף 21 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR לצינורות PCR נקיים. לאחר מכן, מוסיפים 4 מיקרוליטר של צינור ליזה תולעת ומערבבים היטב על ידי pipetting.

לאחר מכן, הפעל את תוכנית ה- PCR בהתאם להנחיות היצרן.