דיסוציאציה של תא בודד של Caenorhabditis elegans: שיטה לבודד תאים חיים

0 צפיות4:51 דק' • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- התחילו עם תולעים כדוריות שטופות והוסיפו חיץ ליזיס המכיל SDS, חומר ניקוי ו-DTT, חומר מחזרים. פעולה זו מפרקת את הקוטיקולה המגנה של התולעת וחושפת את הגוף לדיסוציאציה של תאים. הימנע מחשיפה ממושכת למאגר הליזה כדי למזער ליזה של תאים ומוות.

לאחר מכן, להסיר את ריאגנטים lysis עם כמה שטיפות של מאגר בידוד קר. חשוב כי חיץ זה יהיה של האוסמולריות הנכונה כדי למנוע מוות תאי. השתמשו באנזים פרוטאז כדי לפרק חיבורים בין תאים לתאים. עזרו לתהליך ההומוגניזציה יחד עם אנרגיה מכנית על ידי הצמדת התערובת לדופן הצינור.

הוסף מדיה המכילה סרום כדי לעצור את תגובת האנזים ואנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום. גלולה ולשטוף את הדגימה מספר פעמים כדי להסיר את רוב הפסולת.

לבסוף, הניחו את הצינור על קרח כדי לאפשר שקיעה של כוח הכבידה. פסולת, כולל שאריות של הקוטיקולה או גושי התא, ישקעו, בעוד תאים מנותקים יישארו תלויים בשכבה העליונה של המדיה. תאים אלה יכולים לשמש לתרבית לטווח קצר או לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות על ידי FACS או משקעים חיסוניים.

בפרוטוקול לדוגמה, ננתק תולעים טרנסגניות המבטאות GFP בתאי עצב בעלי עניין לבודד ולנתח תאים אלה.

- לאחר איסוף בעלי החיים, צנטריפוגו אותם במהירות של 1,600 כפול גרם למשך חמש דקות. הסר את כל supernatant ו resuspend את התולעים במיליליטר 1 של מדיה M9. מעבירים את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה בעוצמה של 1,600 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי לגרש את התולעים. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ SDS-DDT ודגרו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. כעת התולעים אמורות להיראות מקומטות לאורך הגוף אם מסתכלים עליהן תחת מיקרוסקופ אור.

לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטר של חיץ בידוד קר כקרח וערבבו על ידי תנועה עדינה של הצינור. צנטריפוגה בעוצמה של פי 13,000 גרם ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לגרש את התולעים. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים עם 1 מיליליטר של חיץ בידוד.

חזרו על תהליך הצנטריפוגה והשטיפה הזה בסך הכל חמש פעמים, והקפידו להסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus מומס במאגר בידוד, על הכדור.

יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. הקפד להפעיל הפרעה מכנית על ידי צנרת למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים עם קצה מיקרופיפטה 200 מיקרוליטר בתחתית הצינור. כדי לקבוע את שלב העיכול, להסיר 1 עד 5 מיקרוליטר של תערובת העיכול, להפיל אותו על שקופית זכוכית, ולבדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות.

לאחר חמש עד שבע דקות, שברי תולעים צריכים להיות בעלי קוטיקולה מופחתת באופן ניכר לעין ותרחיף של תאים יהיה גלוי לעין. לעצור את התגובה על ידי הוספת 900 מיקרוליטר של מדיום L15 זמין מסחרית של Leibovitz בתוספת 10% FBS ופניצילין-סטרפטומיצין.

צנטריפוגה ב 10,000 פעמים גרם וב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי לפטר רסיסים ותאים מבודדים. יש לשטוף את התאים הכדוריים פעמיים נוספות בתוספת L15 קרה באמצעות מיליליטר מדיה לכל שטיפה. להשעות מחדש את התאים גלולות 1 מיליליטר של L15 תוספת מדיה ולהשאיר על קרח במשך 30 דקות.

לאחר מכן, לקחת את השכבה העליונה, שהיא כ 700 עד 800 מיקרוליטר, ולהעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemocytometer כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 מיקרוליטר של תאים מבודדים.

11:01

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:29

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

סרטונים קשורים

0 צפיות

11:34

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

סרטונים קשורים

0 צפיות

03:41

ג. אלגנס דיסקציה של בלסטומיר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

סרטונים קשורים

0 צפיות

03:10

עיכול אנזימטי ודיסוציאציה ידנית: שיטה להכנת עוברים מסוג C. elegans לתרבית תאים

סרטונים קשורים

0 צפיות

02:10

בידוד תאי עצב מ- Caenorhabditis elegans באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:10

שיטה לCulturing עוברי ג elegans תאים

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:42

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

סרטונים קשורים

0 צפיות

06:09

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

סרטונים קשורים

0 צפיות

08:57

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

סרטונים קשורים

0 צפיות

עודכן לאחרונה: 1 אוגוסט 2026