קיבוע אתנול וצביעת DAPI: שיטה להמחשת DNA ב- C. elegans

- מתחילים עם טיפת תמיסת חיץ על מגלשת מיקרוסקופ ומעבירים תולעים שלמות לטיפה. ברגע שהתולעים נמצאות במקומן, השתמשו ברקמה נטולת סיבים כדי לספוג ולהסיר את החיץ. תקן את הדגימה על ידי רחצת הדגימות עם 90% אתנול מספר פעמים, המאפשר לו להתאדות לאחר כל יישום.

לאחר שהאתנול התאדה לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו לדגימה, תמיסה המכילה את צבע חומצת הגרעין, DAPI. DAPI נקשר באופן מועדף לבסיסי אדנין ותימין בחריץ המינורי של הדנ"א. כאשר הוא קשור, קומפלקס DAPI-DNA סופג אור UV ופולט אור כחול נראה.

לאחר מכן הוסיפו חומר משמר נגד דהייה כדי להאריך את חיי המדף של הדגימה. יש למרוח פתק כיסוי ולאטום אותו על השקופית. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן כחול כדי לדמיין גופי DAPI, אשר, בהתאם לתא ולמצב המחזור שלו, יכולים לייצג כרומוזומים בודדים, זוגות כרומטידים אחים או גרעינים שלמים. בניסוי זה נספור זוגות כרומטידים מוכתמים של DAPI בביציות, כדי לזהות זנים טטרפלואידים של Caenorhabditis elegans.

- לזני טטרפלואידים יש 12 זוגות כרומוזומים, אותם ניתן לאמת על ידי ספירת הגופים המוכתמים של DAPI בביציות לא מופרות. כדי לעשות זאת, זרוק חמישה עד עשרה מיקרוליטרים של חיץ M9 על מגלשה והעבר שישה עד 10 טטרפלואידים משוערים לתוך הטיפה. תחת מיקרוסקופ מנתח, ספגו בזהירות את רוב ה-M9 לתוך רקמת ניקוי ללא מוך.

לאחר מכן זרקו 10 מיקרוליטר של 90% אתנול על התולעים וצפו באתנול מתאדה לחלוטין. ברגע שהאידוי מסתיים, חזרו על תהליך הוספת אתנול וצפו בו מתאדה. בסך הכל, להוסיף 10 מיקרוליטר בארבעה יישומים. לאחר שהטיפה האחרונה מתאדה, הוסיפו שישה מיקרוליטרים של DAPI בשני ננוגרם למיקרוליטר, או כתם דומה.

לאחסון לטווח ארוך של המגלשות, הרכיבו את התולעים באנטי-דהייה מסחרית או ביתית. לאחר מכן הוסיפו כיסוי ואטמו את הקצוות בלק. לאחר שהלק התייבש, ניתן להבקיע את המגלשות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדלה של פי 100.

ראשית, למצוא את הביצית הלא מופרית הבוגרת ביותר, אשר צמודה מיד לזרע, ועדיין לא נכנסה לא לזרע ולא לרחם. גופי DAPI כאן הם ככל הנראה זוגות כרומוזומים בודדים. לאחר מכן, התמקדו בגרעין הביצית והשתמשו במיקוד העדין של המיקרוסקופ כדי לסרוק אותו באיטיות, מלמעלה למטה, תוך כדי ספירת גופי DAPI. לאחר מכן ספרו מחדש את גופי DAPI באותו גרעין על ידי הזזת המיקוד מלמטה למעלה.

לביציות מסוג בר יש שישה גופי DAPI בממוצע. נוכחותם של 12 גופי DAPI מצביעה על כך שבעלי החיים בזן זה הם טטרפלואידים חלקיים או מלאים. לנתח לפחות 10 בעלי חיים לכל זן. לעתים קרובות זוגות כרומוזומים יהיו קרובים מאוד או נוגעים ללב, כך שמספר גופי DAPI הוא לעתים קרובות קטן יותר מהמספר האמיתי של זוגות כרומוזומים.