אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 3:24 דק׳ • April 30th, 2023
- ב-C. elegans, RNAi יכול להיגרם על ידי הזנת חיידקי תולעים המבטאים RNA דו-גדילי או dsRNA מפלסמיד DNA רקומביננטי.
כדי להתחיל, לגדל HT115 E. coli עמיד לטטרציקלין נגוע בפלסמיד L4440 בן לילה על לוחות אגר LB סלקטיביים המכילים טטרציקלין ואמפיצילין, או קרבניצלין אנלוגי פונקציונלי שלה. בנוסף לדנ"א המטרה, הפלסמיד מכיל גן לעמידות לאמפיצילין. רק מושבות חיידקים היורשות את הפלסמיד יכולות לגדול בנוכחות אנטיביוטיקה זו.
לאחר מכן, קצרו מושבות חיידקים והרחיבו אותן בתווך LB נוזלי לריכוז הרצוי. כדי לגרום לביטוי dsRNA, העבירו את תמיסת החיידקים למדיום גידול נמטודות מוכן, או NGM, לוחות אגר המכילים IPTG.
במערכת ביטוי זו, IPTG מחקה לקטוז כדי להשבית את מדכא lac המאפשר ביטוי של T7 RNA פולימראז. על הפלסמיד, ביטוי DNA המטרה מווסת על ידי שני מקדמי T7 מתכנסים. כתוצאה מכך, רצפי חושים ואנטי-חושים משועתקים ומובילים לביטוי של dsRNA.
לבסוף, התולעת משתמשת במידע הרצף מה-dsRNA שנבלע כדי להפחית את ה-mRNA האנדוגני עם רצפים משלימים. בניסוי זה נכין צלחות RNAi עם E. coli מהונדס להזנת C. elegans.
- עבור לוחות RNAi, לטעון לוחות 6 ס"מ עם אגר NGM המכיל IPTG ו carbenicillin. תנו להם להתייבש במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, להעביר אותם 4 מעלות צלזיוס עד 14 ימים.
לאחר מכן, פסים לוחות סלקטיביים המכילים קרבניצלין וט
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים