הזנת RNAi בתרבית נוזלית: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשמטת ביטוי גנים ב- C. elegans

- כדי להתחיל, להוסיף carbenicillin ו IPTG מילימולרי אחד כדי לשלוט ולבדוק צלוחיות תרבית המכילות מדיה בסיסית S. סובבו צינור המכיל זחלים בשלב הצמיחה הראשון, הנקרא גם זחלי L1, למשך מספר דקות. עכשיו להסיר את supernatant ומניחים שני מיקרוליטרים של L1s על צלחת אגר. מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ מנתח וסופרים את מספר הזחלים.

הוסף חיידקי RNAi הנושאים פלסמיד RNAi לא ספציפי לבקבוק הבקרה וחיידקים עם RNAi מכוון גנים לבקבוק הבדיקה. כמות החיידקים שנוספו צריכה להיות פרופורציונלית למספר התולעים.

תן לזחלים לגדול עם רעד מתמשך כדי להבטיח חמצון תקין. הזחלים ניזונים מהחיידקים. בתוך הזחל, הרנ"א המפריע הקטן נקשר ל-mRNA המשלים המיוצר על ידי גן המטרה ומעכב ביטוי חלבונים. לבסוף, בחן את התולעים עבור הפנוטיפ של העניין שלך.

בפרוטוקול לדוגמה, נטפל בזחלי L1 עם RNAi המכוון לגן daf-2, בתרבית נוזלית.

- כדי להתחיל בטיפול, הוסף 207.45 מיליליטר של מדיה בסיסית S עם ריאגנטים נוספים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לצלוחית תרבית פרנבך 2,800 מיליליטר. מוסיפים ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר קרבניצילין ומילימולר אחד של IPTG, וסוגרים את הבקבוק עם מכסה בורג ממברנה.

הוציאו את ה-L1s מאינקובטור של 25 מעלות צלזיוס והעבירו אותם לצינורות של 15 מיליליטר. צנטריפוגו את ה-L1s במהירות של 1,900 פעמים גרם למשך שלוש דקות. לאחר סיבוב, להסיר את supernatant. תחת מיקרוסקופ, לספור את L1s לכל שני מיקרוליטר, וממוצע את המספרים המתקבלים לפחות תשע טיפות.

לאחר מכן, הוסיפו 50,000 תולעים לאוסף התולעים הצעירות ו-100,000 תולעים לאוסף התולעים המיושנות לארבע צלוחיות תרבית פרנבך שהוכנו בשלב הקודם. לאחר מכן הוסף חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין באופן יחסי למספר התולעים.

לאחר הוספת חיידקים, השלם תרבית תולעים עם S בזאלי כדי להביא את הנפח הכולל ל 300 מיליליטר. דוגרים על תרבית התולעים ב-25 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-150 סל"ד עד לאיסוף.