ג. אלגנס דיסקציה של בלסטומיר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

- לדיסקציה זו יש להשתמש בשתי מיקרופיפטות (micropipettes): אחת בעלת פתח ברוחב זהה לזה של ביצה ואחת ברוחב כפול, וסדרה של תמיסות המאורגנות בבארות כדי לאפשר מעבר מהיר ביניהן.

ראשית, הכניסו הרמפרודיטים בוגרים לתמיסת מלח ביצה, המאוזנת אוסמוטית כדי למנוע התפוצצות עוברים. חתכו את התולעים לשניים כדי לשחרר את העוברים המתפתחים.

לאחר מכן, זהה עוברים בשלב שני תאים. תאים אלה הם הבלסטומרים שנוצרו על ידי חלוקת הביצית המופרית. השתמשו במיקרופיפטה עם הפתח הגדול יותר כדי להעביר עובר לתמיסת היפוכלוריט, אקונומיקה, שתתחיל לפרק את קליפת הביצה המגינה.

לאחר 40 עד 55 שניות בלבד, העבירו את העובר למדיום הגדילה של שלטון, או SGM. שטפו כל עובר לזמן קצר בשתי בארות של SGM כדי להסיר את כל עקבות האקונומיקה לפני הכנסתם לבאר שלישית.

כעת, השתמשו במיקרופיפטה הקטנה יותר כדי לבצע פיפטה חוזרת ונשנית של העובר, מה שמספק את הכוח המכני להסיר את קליפת הביצה ולחשוף את הבלסטומרים. ממשיכים בעדינות לקפטף את העובר כדי להפריד את תאי הבלסטומרים הבודדים. בפרוטוקול הבא, נראה טכניקה זו בפעולה.

- החזיקו כל קצה של מיקרוקפילרי בקיבולת של 10 מיקרוליטר ביד ימין ושמאל. משוך את המיקרו-נימים לכיוון שני הקצוות כדי להפעיל מתח והבא את מרכז הנימים מעל מבער כדי ליצור שני נימים שנמשכו ביד.

תחת המיקרוסקופ המנתח, חותכים את קצות הנימים ביד עם מלקחיים. בצעו את שני גדלי פתיחת החוד בערך פי שניים ופי אחד מאורך הציר הקצר של עוברי C. elegans להחזרת עוברים והוצאת קליפת ביצית, בהתאמה.

חבר את הנימים המשוכים לתוך מנגנון פיטום הפה. פיפטה 45 מיקרוליטר של תמיסת מלח ביצים על באר של מגלשה מרובת בארות.

מניחים 5 עד 10 C. elegans בוגרים על הבאר. כדי להשיג עוברים מוקדמים של C. elegans, חתכו את הבוגרים לחתיכות על ידי מיקום שתי מחטים מימין ומשמאל לגוף C. elegans והחלקת המחטים זו על פני זו.

פיפטה 45 מיקרוליטר של תמיסת היפוכלוריט על באר ליד הבאר המכילה תמיסת מלח ביצים, ופיפטה 45 מיקרוליטר של מצע הגידול של שלטון על שלוש הבארות הבאות. העבירו עוברים בשלב חד תאי ובשלב מוקדם של שני תאים לתמיסת היפוכוריט על ידי פיפטה בפה עם פתח בגודל גדול יותר והמתינו 40 עד 55 שניות.

שטפו את העוברים על ידי העברתם לשלוש הבארות הבאות עם מדיום הגידול של שלטון עם 1 עד 2 שניות בכל אחת משתי הבארות הראשונות. בעזרת הנימים המצוירים ביד עם פתח קטן יותר, חוזרים בזהירות על פיטום העובר להסרת קליפת ביצה.

לאחר מכן, פיפטה ברציפות עם נימי מצויר ביד כדי להפריד את שני תאים שלב הבלסטומרים העובריים.

- לאחר הסרת קליפת הביצית, מזערו את הכוח בהטלת עוברים למעלה ולמטה כדי למנוע התפוצצות.