אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 3:10 דק׳ • April 30th, 2023
- התחילו עם ביצים כדוריות שבודדו על ידי הלבנת תולעים בוגרות. ודא שכל שלב של הליך זה מתבצע באופן סטרילי כדי למנוע זיהום של תאים בתרבית. השהו את הגלולה בתמיסה של כיטינאז, אנזים המפרק כיטין - פוליסכריד גדול המהווה מרכיב מבני של קליפת הביצה.
לאחר תקופת עיכול מתאימה, צנטריפוגו בעדינות את הביצים והחליפו את הסופרנאטנט במדיום תרבית תאים כדי לעצור את העיכול. לאחר מכן, העבירו את העוברים דרך מחט של 18 מד כדי להפריד באופן מכני תאים בודדים. לאחר מכן, סנן את התמיסה כדי להסיר פסולת מקליפת הביצה או גושי תאים לא מופרדים. לוחים את התאים בצלחת תרבית על פתק כיסוי זכוכית המצופה באגלוטנין בוטנים - לקטין המסייע לתאים להיצמד לחלקת הכיסוי על ידי קשירת פחמימות משטח התא.
בפרוטוקול לדוגמה נכין תאים עובריים להתמיינות ואנליזה מורפולוגית חוץ גופית.
- תוך כדי עבודה מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום חיידקי, יש להשהות מחדש את הביצים הכדוריות במיליליטר אחד של שני מיליגרם למיליליטר צ'יטינאז ולהעביר אותן לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר. רוקנו את הצינור במשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, בהתאם לרעננות האנזים. כאשר כ-80% מקליפות הביצים מתעכלות, צנטריפוגות את הביצים ב-900 גרם למשך שלוש דקות.
לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, מוסיפים שלושה מיליליטר של מדיום L15. מעבירים את הביצים לצלחת בקוטר שישה סנטימטרים ומתחילים בדיסוציאציה ידנית באמצעות מזרק סטרילי 10 מיליליטר עם מחט 18 מד. כדי לפקח על מידת הדיסוציאציה, הניחו טיפת תרחיף לתוך צלחת פטרי טרייה וצפו מתחת למיקרוסקופ. המשיכו עד שכ-80% מהתאים מנותקים.
כדי להסיר גושי תאים, ביצים לא מעוכלות וזחלים שבקעו, סננו בעדינות את התרחיף דרך מסנן של חמישה מיקרון והעבירו ארבעה עד חמישה מיליליטר נוספים של תווך L15 דרך המסנן כדי לשחזר את התאים. כדי לתרבית את התאים לאחר צנטריפוגה של התסנין ב 900 גרם במשך שלוש דקות, להשהות מחדש את התאים בתווך L15 מלא. צלחת מיליליטר אחד לכל באר, ואחסן צלחות בתא אטום ולח ב 20 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה.