ג. אלגנס מעקב אחר תנועה: שיטה להערכת תנועה בתולעים

- כדי להעריך תנועה ב- C. elegans, השתמש במצלמה כדי לתעד את תנועת התולעים על צלחת אגר, ולהבטיח הארה אחידה של הצלחת במהלך ההקלטה. כדי להגביל את תנועת התולעים סביב הצלחת, השתמשו בטבעות נחושת. נחושת מרתיעה את C. elegans, ולכן תולעים כלואות בתוך הטבעות.

הניחו מספר טבעות נחושת על צלחת אחת כדי לעקוב בו-זמנית אחר תולעים בכל טבעת. זה מאפשר הערכה של בעלי חיים בקרה וניסוי להתבצע בתנאים זהים, להפחית את השונות היומיומית ולאפשר השוואות זו לצד זו. תעד את תנועת התולעים על פני מרווחי זמן קבועים, והשתמש בתוכנת מחשב כדי לנתח תכונות של התנהגות הקטר, כגון מהירות התנועה והמרחק שעבר.

בפרוטוקול לדוגמה, נראה הדגמה של בדיקת מעקב תנועה הבודקת את השפעות האלכוהול על מהירות התנועה של התולעת.

- כדי להתחיל, קח שתי דקות או פחות להעביר 10 תולעים מכל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת אקלום. זוהי צלחת ללא אתנול. הימנע העברת מזון עם התולעים כפי שהוא יפחית את התנועה שלהם. כמו כן, הימנעו מפגיעה במשטח האגר מכיוון שהתולעים יתחפרו. רשמו את זמן ההעמסה על הצלחת, והקפידו להקדים את העברת התולעים לכל צלחת ביותר משתי דקות, כך שניתן יהיה לצלם כל צלחת בנפרד במרווח הזמן המתאים.

תנו לכל צלחת אקלום לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את התולעים לצלחת הבדיקה, בהתאם לסדר המשמש להנחת התולעים על צלחת ההתאקלמות. בעזרת קוטף תולעים שטוח בעל קצוות דקים ללא חיידקים, אספו את התולעים על גבי הקטיף השטוח באמצעות תנועת גריפה. לאחר מכן, אטמו את הצלחת עם סרט מעבדה כדי למזער את אובדן האתנול לאידוי.

- המהירות שבה בעלי החיים מועברים בשלב זה חשובה מאוד, מכיוון שבעלי החיים המועברים ייחשפו לאתנול זמן רב יותר. לכן כדאי לסובב אילו זנים מונחים על הצלחת תחילה על פני שכפולים ניסיוניים.

- מיקרוסקופ עם מצלמת וידאו ברזולוציה גבוהה נדרש כדי לצלם את התולעים עכשיו. אפילו תאורה, למשל מתאורה אחורית מרובעת בגודל שלושה אינץ', חיונית לניתוח. לאחר מכן, כדי לשמור על ניגודיות, דמיינו את מדיית הלוח כלפי מעלה.

הכן את תוכנת ניתוח התמונות כדי לצלם סרטים של 120 פריימים, 12 סיביות, גווני אפור וקיטועי זמן בפריים אחד לשנייה. כדי להקטין את קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספקת, השתמש במצב בינינג של שניים על שניים.

כעת הקליטו סרטים בני שתי דקות מכל צלחת, 10 דקות לאחר שהונחו אחרוני התולעים על הצלחת. ואז לעשות הקלטה שנייה של שתי דקות, 30 דקות לאחר תולעים הונחו על הצלחת. עבור הדגמה זו תוכנת Image-Pro Plus משמש, כמו מגוון רחב של תוכנות אחרות ניתן להתאים את הטכניקה. נתחו את הסרטים כמקטעים בני שתי דקות.

תחילה החילו מסנן על התמונות שמשטיח את הרקע ומשפר את הניגודיות של עצמים תולעים. תחת התפריט, בחר תהליך, לאחר מכן מסננים, לאחר מכן שיפור ולאחר מכן שיטוח. הגדר את הפרמטר עבור רקע כהה ורוחב תכונה של 20 פיקסלים.

כעת, נתחו את תנועת החיות בכל טבעת בנפרד עם אזור עניין מעגלי החופף לטבעת הנחושת. זהה את התולעים ועקוב אחריהן באמצעות הפקודה עקוב אחר אובייקטים בתפריט המשנה מדידה.

בחלון טבלת נתוני מעקב, השתמש בלחצן אפשרויות מעקב כדי לאפשר אי הכללת רצועות ספציפיות ולהגביל תוצרים ניסיוניים. תחת הכרטיסייה מעקב אוטומטי, הגדר את פרמטרי המסלול למגבלת מהירות של 400 מיקרון למסגרת. הגדר את מגבלת ההאצה לאוטומטית.

הגדר את אורך המסלול הכולל המינימלי ל- 400 מיקרון, והגדר את סוג התנועה השולט לכאוטי. לאחר מכן, תחת פרמטר מסלול, הגדר את האובייקטים כך שיאפשרו לרצועות חלקיות להיות באורך מינימלי של 21 מסגרות ושיהיה להן עומק הקרנת מעקב של מסגרת אחת.

כעת, כדי להתחיל את תהליך המעקב, תחילה לחץ על הלחצן מצא את כל המסלולים באופן אוטומטי פונקציה. פעולה זו מציגה את תיבת הדו-שיח אפשרויות ספירה/גודל ואת תיבת הדו-שיח מעקב. בחרו באפשרות 'ידני' לבחירת טווח העוצמה בתיבת הדו-שיח 'ספירה/גודל'. זה מספק שלב סף חשוב. לאחר מכן מתאים את מחווני סף העוצמה ליצירת טווח כולל המסמן עצמים כהים. נקודת התחלה טובה בסולם היא בין 0 ל-1,500.

כעת החילו מסנן גודל כדי לא לכלול עצמים גדולים או קטנים יותר מתולעת יחידה. עבור אל תפריט מדידה ולאחר מכן בחר תפריט משנה מדידה. פעולה זו פותחת את תיבת הדו-שיח 'אפשרויות ספירה/גודל'. שם, הגדר את טווח השטח ל 28,000 עד 120,000 מיקרון רבוע. ולהגדיר את הטווח ההיקפי ל 600 עד 2,500 מיקרון. בצע התאמות לפרמטרים אלה בעת שימוש בתולעים בגודל חריג.

כעת, השלם את תהליך המעקב על-ידי לחיצה על המשך בתיבת הדו-שיח מעקב. בדוק שוב שהפלט עוקב עם קטעי הסרט. ודא שכל תולעת מיוצגת, אלא אם כן יש סיבה ברורה לסנן אותה. לאחר מכן, מחק ידנית רצועות שנוצרו על ידי אובייקטים שאינם תולעים.

לאחר מכן, חשב את המהירות של כל תולעת על ידי ממוצע המרחק שעבר בין כל פריים או כל שנייה, וצור מהירות ממוצעת עבור המסילות בכל אוכלוסייה. חשבו על הממוצע הסופי הזה כנקודת מדגם אחת לניתוח סטטיסטי של הניסוי.