אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 2:23 דק׳ • April 30th, 2023
- הניחו תולעת טרנסגנית אחת המבטאת GCaMP - חלבון חישת סידן - בתא הדמיה יחד עם מזון חיידקי לתולעת. לאחר מכן אטמו את המנה עם המכסה וסרט המעבדה כדי למנוע אידוי. צפו בו תחת מיקרוסקופ מורכב המצויד לאפיפלואורסנציה של שדה רחב. הקלט תמונות בהילוך מהיר של התולעים כדי לעקוב אחר התנהגותן וללכוד פלואורסצנטיות באמצעות תוכנת הדמיה.
תולעים טרנסגניות מבטאות חלבון חיישן GCaMP תחת שליטה של מקדם המניע ביטוי GCaMP בנוירון מסוים. כאשר תא עצב זה מופעל, הוא יורה פוטנציאל פעולה, אשר depolarizes קרום פלזמה. עם דה-קיטוב, תעלות סידן מגודרות מתח נפתחות בקרום הפלזמה. זה גורם לזרימה של יוני סידן לתוך התא, וכתוצאה מכך עירור עצבי.
GCaMP בתא העצב הנרגש קושר את יוני הסידן. זה גורם GCaMP פלואורסצנטי כאשר התולעים מצולמות עם אור עירור פלואורסצנטי בעוצמה נמוכה. בפרוטוקול לדוגמה, נשתמש בדימות סידן כדי להמחיש פעילות בין-עצבית AVA בתאי C. elegans טרנסגניים במיקרו-תאים של אגרוז.
- הדמיית סידן מבוצעת במיקרוסקופ מורכב המצויד לאפיפלואורסצנטיות שדה רחב. כדי להגביל את החשיפה לאור, השתמש באות לוגי טרנזיסטור-טרנזיסטור המפעיל נורית LED כדי להאיר את הדגימה באותו זמן שהמצלמה מקליטה מסגרת.
הפעל סרט ברצף במשך 24 שעות שמצלם כל תולעת כל 15 עד 30 דקות. ראשית, הקלט 20 שניות עם DIC, לאחר מכן 20 שניות עם פלואורסצנטיות GFP, ולבסוף, תמונה של אות mKate2 עבור רמות ביטוי שליטה.
לבדיקת נתונים חזותיים, השתמש במפת צבע מזויפת כדי לשפר את הנראות של שינויים קטנים בעוצמת הפלואורסצנטיות. לבסוף, בצע ניתוח נתוני סידן באמצעות הליכים סטנדרטיים.