אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 3:21 דק׳ • April 30th, 2023
- כדי להתחיל, להעביר תולעים בוגרות צעירות על כרית אגרוז טרי על מגלשה. לאחר מכן להוסיף כמה טיפות של 12 מילימולר levamisole פתרון כדי לשתק את התולעים. מכסים את התולעים בכיסוי ומחכים מספר דקות. הניחו את המגלשה מתחת לדיסק מסתובב, מיקרוסקופ קונפוקלי והתמקדו במשטח החיצוני הצדדי ביותר של התולעת.
האפידרמיס של תולעת בוגרת הוא מבנה חד-שכבתי דק המורכב מסינקיטיה רב-גרעינית הנובעת מאירועי איחוי תאים. פני השטח האפיקליים של האפידרמיס מפרישים קוטיקולה קולגן גמישה, בעוד שמשטח הבסיס מכוסה בשכבה דקה של מטריצה חוץ-תאית הנקראת למינה בסיסית.
לאחר מכן, פצע את פני השטח האפי של האפידרמיס עם לייזר. ציטופלסמה מהתאים הפגומים עלולה לדלוף החוצה, ולהופיע כבועה באתר הפצע.
להקרנת לייזר יש יתרון על פני טכניקות אחרות, כגון פציעה במחט, שכן היא גורמת להפרעה מקומית של תאי הקוטיקולה והאפידרמיס, מבלי לפגוע ברקמות הפנימיות. בפרוטוקול לדוגמה, נראה את תהליך הפציעה בלייזר ב- C. elegans.
- כדי לפצוע במדויק את הנמטודות, פרוטוקול זה משתמש בלייזר פמטו-שניות המחובר למיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. סריקות קו או נקודה באמצעות לייזר פמטו-שניות, כגון אלה במיקרוסקופ של שני פוטונים, אמורות גם הן להספיק.
- התחילו באיסוף 10 צעירים על משטח אגר. לשתק אותם בטיפה של שני מיקרוליטר של תמיסת levamisole 12 מילימולרי. לאחר מכן כסו אותם בפתק כיסוי והמתינו מספר דקות בזמן שהם משתקים.
- חיוני שבעל חיים יהיה משותק לחלוטין. 12 מילימולר levamisole לא ישפיע על תגובת הפצע. עם זאת, שיטות אחרות של immobilization ניתן להשתמש גם.
- ודא כי עוצמת הלייזר femtosecond מוגדר על 140 מילי וואט, כפי שנמדד לפני המטרה, ואת קצב החזרה לייזר הוא על 80 מגה הרץ. כעת, אתרו את התולעים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. באמצעות מטרה של 100x עם צמצם מספרי גבוה, התמקדו באפידרמיס הסינסיטיאלי הקדמי או האחורי של תולעת המטרה.
תוך התמקדות במשטח האפי של תא האפידרמיס, להאיר את הלייזר לשני פולסים של 200 אלפיות השנייה המופרדים על ידי 20 אלפיות השנייה. זה צריך להיות מספיק כדי לפצוע את האפידרמיס. חכו רגע והתבוננו בהפרעה המקומית של הציטופלסמה, שתיראה כמבעבעת. אם קיים סמן פלואורסצנטי, ניתן להבחין בהלבנה מקומית.