האכלת FITC-Dextran: שיטה לכימות חדירות המעי ב- C. elegans

- C. elegans משמש כמודל ניסיוני של זיהום על ידי פתוגנים במעיים הגורמים למחלות, בין היתר, על ידי שיבוש מחסום המעי והגברת חדירותו. כדי לכמת את שלמות המחסום לאחר חשיפה לחיידק או לתרכובת כימית מעניינת, אספו תולעים על ידי שטיפתן מהצלחת שלהן.

לאחר מכן, הניחו את התולעים האלה על צלחות אגר עם מזון מסומן המורכב מאי-קולי שהומת בחום מעורבב עם FITC-dextran, פוליסכריד במשקל מולקולרי גבוה עם תג פלואורסצנטי.

אפשרו לתולעים לאכול את החיידקים המסומנים. אלה עם מחסומי מעיים שלמים יפנו במהירות את המזון, ואילו בתולעים עם מעיים חדירים יותר, הסמן הפלואורסצנטי יחדור מעבר לומן של האיבר.

מעבירים תולעים לתמיסת פורמלדהיד כדי לתקן את בעלי החיים. לאחר 1 עד 2 דקות, להחליף את פורמלין עם מדיה הרכבה.

לבסוף, דמיינו את התולעים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימו לב שגרגירי המעי של C. elegans הם אוטופלואורסצנטיים, כך שיהיה אות רקע. אבל בסך הכל, יותר פלואורסצנטיות מעיים מצביעה על חדירות גבוהה יותר.

בפרוטוקול לדוגמה, נבחן את השפעת הטיפול בביומולקולה DIM על חדירות המעי של תולעים נגועות בחיידקי Pseudomonas aeruginosa פתוגניים.

- הכינו את הצלחות בתוספת FITC-dextran על ידי ערבוב 2 מיליליטר של E. coli מומת בחום עם 4 מיליגרם של FITC-dextran. הוסיפו 100 מיקרוליטר מהתערובת לכל אחת מ-20 צלחות אגר NGM טריות והניחו לצלחות להתייבש במשך שעה על ספסל מעבדה נקי. לאחר 48 שעות של טיפול, לשטוף את התולעים עם S Buffer. העבירו אותם לצלחות בתוספת FITC-dextran ולצלחות NGM ללא FITC-dextran ודגרו על הצלחות למשך הלילה.

למחרת, שטפו את התולעים עם S Buffer ואפשרו להן לזחול בצלחת האגר הטרייה של NGM למשך שעה. מוסיפים 50 מיקרוליטר של פורמלדהיד 4% לכל באר של צלחת שחורה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות ומעבירים כ-50 תולעים לכל באר. לאחר 1 עד 2 דקות, להסיר את כל פורמלין ולהוסיף 100 מיקרוליטר של בינוני הרכבה לתוך כל באר.

- פורמלדהיד הוא כימיקל רעיל ויש לטפל בו בזהירות.