אבלציה ממוקדת בכבד: גרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים

- להמיס metronidazole במי ביצה המכילים DMSO, ממס, ולהוסיף phenylthiourea, אשר מונע היווצרות פיגמנט בעוברים. מעבירים כמה זחלים בגיל המתאים לצלחות טיפול ובקרה. לאחר מכן, הוסף את הריכוז הרצוי של תמיסת metronidazole לצלחת הבדיקה ומי ביצה המכילים DMSO לצלחת הבקרה.

תנו לזחלים בשתי הצלחות לגדול ב 28 מעלות צלזיוס. הזחלים הטרנסגניים מייצרים ניטרורדוקטאז רק בהפטוציטים, אשר ממיר את המטרונידזול לתרופה ציטוטוקסית, וכתוצאה מכך מוות רק של הפטוציטים הממוקדים. לאחר הטיפול, להסיר את הפתרון metronidazole מן צלחת הטיפול ולשטוף את העוברים עם מי ביצה.

הוסיפו טריקאין כדי להרדים את הזחלים ובדקו אותם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לאבלציה חמורה של הפטוציטים - הרס תאי כבד. תוכלו לראות כבד הרבה יותר קטן אצל אנשים מטופלים מאשר אצל אנשים בקבוצת ביקורת. בפרוטוקול לדוגמה, נשתמש במטרונידזול עבור אבלציה של הפטוציטים בזחלי דגי זברה טרנסגניים כדי לחקור התחדשות כבד.

- מעבירים עד 100 עוברים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 25 מיליליטר מי ביצה ומניחים את התבשיל על 28 מעלות צלזיוס. כדי לעכב פיגמנטציה, הוסף PTU לתרבית עד 10 שעות לאחר ההפריה. 80 שעות לאחר ההפריה, מרדימים את הזחלים עם טריקאין ומשתמשים במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לאסוף את הזחלים החיוביים ל-CFP, ושומרים רק על בעלי החיים עם כבדים בגודל דומה

לאחר מכן החליפו את מי ביצת הטריקאין במי ביצים טריים בתוספת PTU והחזירו את זחלי דגי הזברה החיוביים ל-CFP לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. כדי לטפל בזחלי דגי הזברה עם MTZ, ראשית, לחלק את המספר המתאים של הזחלים לשני כלי תרבית שונים. שמור את קבוצת הזחלים הניסיוניים בתמיסה של MTZ טרי מוכן ואת קבוצת הביקורת במי ביצים בתוספת DMSO.

כסו את קבוצת הניסוי ברדיד אלומיניום כדי למנוע השבתת צילום של MTZ ודגרו על שתי קבוצות זחלי דגי הזברה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. בתום תקופת האבלציה, הסר את תמיסת MTZ מהצלחות ושטוף את הלבה המטופלת ב- MTZ פעמיים עד שלוש עם 25 מיליליטר מי ביצים ומערבולת, תוך השלכת מי הביצה לאחר כל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, לשתק את הזחלים עם מחצית ריכוז של טריקאין ששימש בעבר כדי למנוע בצקת לב ומוות בזחלים שטופלו MTZ. לאחר מכן השתמש במסנן CFP במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי להעריך את רמות אבלציה של הפטוציטים בהתבסס על גודל הכבד היחסי של הלבה שטופלה ב- MTZ. ניקח לדוגמה את דגי הזברה עם כבדים גדולים המייצגים 0% עד 5% מהזחלים כבלתי נבטלים, אלה עם כבדים בינוניים המייצגים 10% עד 20% מהזחלים להיות מובטלים חלקית, ואלה עם כבדים קטנים מאוד המייצגים 80% עד 90% מהזחלים להיות ablated מלא.