הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

- גישה אחת לקביעת תפקודו של גן היא להפיל את הביטוי שלו ולבחון את ההשפעה. אוליגומרים מורפולינו משמשים לעתים קרובות במחקרי הפלה בדגי זברה. מורפולינו היא מולקולה סינתטית דמוית דנ"א באורך של כ-25 בסיסים, המעכבת ביטוי של גני מטרה.

לטיפול במורפולינו, הניחו דג מורדם עם סנפיר זנב קטוע חלקית על צלחת הזרקה ומקמו את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו. יש להזריק רק את הצד הגבי בעוד הצד הגחוני החד גוני משמש כבקרה. מורפולינים יכולים לתפקד בשתי דרכים בהתאם לרצף אליו הם מכוונים. ראשית, הם משתלבים לאתר התחלת התרגום על mRNA ומונעים סינתזת חלבונים על ידי חסימת התרגום.

שנית, הוא יכול להיקשר לצומת אינטרון-אקסון על גבי קדם-mRNA ולמנוע שחבור תקין, וכתוצאה מכך נוצר שעתוק פגום שיתפרק על ידי התא. מאוחר יותר, לבחון את הסנפירים הקאודליים עבור צמיחה. הבדלים בין צמיחה מחודשת של אזורים שטופלו במורפולינו לבין אזורים שלא טופלו מצביעים על כך שהחלבון הממוקד ממלא תפקיד בהתחדשות סנפירים. בפרוטוקול זה, נשתמש במורפולינוסים כחלק מבדיקת התחדשות סנפיר קאודלי.

- יום לפני הזרקת מורפולינו, הכינו צלחת הזרקה עם 2% אגרוז עם חריץ חתוך בקצה אחד של הבאר, מה שיעזור לייצב את הדג להליך ההזרקה. רגע לפני ההזרקה, מדללים את המורפולינו המתויג פלואורוסצאין במים נטולי RNAase ו-DNAase לריכוז הנכון ודגרים עליו באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טען מחט הזרקה שהוכנה בעבר וחתך את הקצה בזווית.

לאחר מכן, מרדימים את הדג ומניחים אותו על צלחת ההזרקה. הסר את כל הנוזלים העודפים והנח את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. כיוון המחט רק דיסטלית לקרן הגרמית.

הכנס את המחט בעדינות לתוך הרקמה הרגנרטיבית רק דיסטלית לכל קרן גרמית ודחוף באופן מרוחק עד למיקום בבלסטמה. כאשר המחט ממוקמת כראוי, עקוב אחר הוראות מערכת המיקרו-הזרקה והזריק טיפה של חמישה ננוליטר של המופולינו בכל הזרקה. עם כל זריקה, נשיפה צהובה של תמיסת מורפולינו ניתן לראות, אשר מסייע למקם את הזריקה לבלסטמה. בעבודה גבית מקו האמצע, מזריקים כ-75 ננוליטר מורפולינו לכל קרן גרמית בצד הגבי, ומשאירים את הצד הגחוני כבקרה אלקטרופורציה בלבד.