אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 2:57 דק׳ • April 30th, 2023
- התחל את ההליך על ידי הנחת דג בוגר מורדם על ערימת נייר סופג. כעת השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את סנפיר הזנב ולהעביר במהירות את הדג למיכל המכיל מים מתוקים להתאוששות. העבירו את תפס הזנב לצינור נקי המכיל חיץ ליזיס. חיץ הליזיס מכיל דטרגנטים לא יוניים, המסיסים את קרום הפלזמה ואת קרום הגרעין של התא. החיץ מכיל גם אנזים בשם פרוטאינאז K המפרק חלבונים ומאפשר שחרור DNA לתוך הליזט. הוא גם מפרק נוקלאזות, ומגן על הדנ"א מפני עיכול נוקלאז.
כעת, השאירו את הצינורות עם אטבי זנב באינקובטור למשך הלילה כדי לפרק לחלוטין את הרקמה ב 55 מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף. לאחר מכן, מחממים את הצינור ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית פרוטאינאז K. צנטריפוגה את הצינור כדי לגלול חומר מעוכל ולהעביר את supernatant המכיל DNA לצינור אחר. הוסיפו אלכוהול כדי לזרז את הדנ"א וצנטריפוגה שוב כדי לאסוף את הדנ"א בכדור. בפרוטוקול הבא נבודד DNA מקליפ זנב של דג זברה בוגר ומעובר שלם.
- ביום הכנת הדנ"א יש להוסיף פרוטאינאז K טרי למאגר הליזיס בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר. ניתן לאסוף רקמות מדג בוגר באמצעות קליפס סנפיר או מדג עוברי.
ראשית, להרדים את הדגים בתמיסת טריקאין. המתן עד שתנועות הזימים יהיו איטיות. לאחר מכן, לשים את הדג על ערימה של רקמות, עם סכין גילוח סטרילי, לחתוך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב על 2 עד 3 מ"מ אורך. הניח במהירות את הדג במיכל מסומן עם מים מתוקים להתאוששות.
הרימו את אטב הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילי והעבירו אותו לצינור מלא במאה מיקרוליטרים של מאגר DNA lysis. הקפד לתייג גם את המיכל של החיה וגם את הצינור. לדגור על כל הרקמות שנאספו במשך ארבע שעות לפחות ועד לילה ב 55 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, להשבית את proteinase K על ידי חימום צינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. דגימות אלה יש להשתמש עבור PCR באופן מיידי, אבל ניתן לאחסן גם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים.