הרכבה שכבתית של אגר: הכנת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח במיקרוסקופ הפוך

- התחילו עם צלחת פטרי המכילה עוברים בתווך E3. הוסף טריקאין כדי להרדים את העוברים ופנילתיאוריה, תמיסת PTU, כדי לעכב היווצרות פיגמנט. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, dechorionate את העוברים.

השתמשו בפיפטת זכוכית כדי להעביר את אחד העוברים הדכוריוניים לצלחת פטרי קטנה עם תחתית זכוכית רדודה היטב במרכז והסירו את התווך העודף. לאחר מכן, הניחו תמיסת אגרוז בריכוז אופטימלי כדי למזער את העיוות והתנועתיות של העובר לתוך צינור מיקרופוגה וחממו אותו. הורידו את הטמפרטורה ל-30 מעלות צלזיוס כדי למנוע פגיעה בעובר בגלל החום.

יוצקים את השכבה הראשונה של agarose על העובר, לחלוטין למלא את הבאר הרדודה. מניחים כיסוי נוספת מעל הבאר ומוסיפים 1% אגרוז על גבי זה. השכבה השנייה מחזיקה את זכוכית הכיסוי במקומה.

לאחר שהאגרוז מתמצק, ממלאים את צלחת הפטרי בתווך E3 המכיל טריקאין. זוהי השכבה השלישית ושומרת על האגרוז והעובר רוויים. בפרוטוקול הבא, נבצע הרכבה שכבתית של אגר של עוברי דגי זברה להדמיית קיטוע זמן ממושך.

- ממש לפני ההרכבה, מחממים את תמיסת האגרוז ל-65 מעלות צלזיוס ואז נותנים לה להתקרר לכ-30 מעלות צלזיוס כדי שהעובר לא ייפגע מהחום ומוסיפים טריקאין לתמיסת האגרוז. השתמשו בכלים תחתונים מזכוכית 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מכוסה מספר אפס. מניחים בעדינות עובר dechorionated עם אחד הצדדים הצדיים שלו לכיוון החלק התחתון של הצלחת עם פיפטה זכוכית או micropipette. לאחר מכן בזהירות להסיר כל E3 שנותר עם micropipette.

מוסיפים את תמיסת האגרוז הראשונה לבאר הקטנה שנוצרה על ידי זכוכית הכיסוי המחוברת לתחתית הצלחת כדי לכסות את העובר, ומוודאים שהאגרוז מכסה את הבאר הקטנה אך אינו עולה על גדותיה. מכסים את הבאר הקטנה בזכוכית הכיסוי ליצירת חלל צר מלא אגרוז עם העובר בין שתי כוסות הכיסוי. הניחו שכבה של תמיסת אגרוז 1% על גבי הכיסוי על כל תחתית המנה, שתשמור על הכיסוי במקומה כשהיא מתמצקת. לאחר מכן מלאו את החלק הנותר של המנה עם E3 המכיל 0.02% טריקאין כדי לשמור על המערכת hydrated. כדי לזהות את ריכוז האגרוז האופטימלי לשכבה הראשונה, יש להרכיב את העוברים בריכוזים הולכים וגדלים של אגרוז ולבצע הדמיית Timelapse כדי לזהות את הריכוז שממזער את העיוות והתנועתיות של העוברים, ולאחר מכן לבדוק טווח עדין יותר של ריכוזים בהתבסס על התוצאות.

- השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא לזהות את הריכוז האופטימלי של אגרוז עבור שכבה ראשונה. בדוק ריכוזי ננו שונים של אגרוז כגון 0.030%, 0.032% וכו ', כדי למצוא את הריכוז האופטימלי.