אגר הרכבה: שיטה בסיסית להרכבת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח

- מתחילים בהוספת אגרוז E3 נקודת התכה בינונית עד נמוכה ומחממים עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין. מצננים את האגרוז ל-37 מעלות צלזיוס ומוסיפים תמיסת טריקאין. לאחר מכן, הרדימו את העוברים על ידי הוספת טריקאין לצלוחית פטרי המכילה עוברים בתווך E3. מערבלים את צלחת הפטרי כדי לאסוף את העוברים באמצע.

באמצעות פיפטה החזרה, לצייר עובר אחד עם כמות מינימלית של מדיום. החזיקו את הפיפטה במצב זקוף והקפיצו את העובר כדי למקם אותו בקצה הפיפטה. כעת הניחו את העובר בתמיסת האגרוז מבלי להוסיף כל מדיום עודף, אשר ידלל את האגרוז וימנע ג'לינג. מערבבים בעדינות את העובר בתוך האגרוז ומעבירים את התמיסה לבאר של צלחת הדמיה באמצעות הפיפטה.

מניחים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ ומשתמשים בקצה פיפטה כדי למקם את העובר בכיוון הרצוי. לאחר שהאגרוז מתמצק, שפכו עליו מדיום E3 המכיל טריקאין כדי לשמור על לחות האגר ולדמיין את העובר. בפרוטוקול לדוגמה, נרכיב עוברים פרביוטיים של דגי זברה לצורך הדמיה וניתוח.

כדי להשיג תמונות של העוברים המאוחים, הכינו אגרוז של 0.8% נקודת התכה נמוכה. בעודו עדיין חם, aliquot מיליליטר אחד של agarose לתוך צינורות microfuge 1.5 מיליליטר להגדיר בלוק חימום 37 מעלות צלזיוס. להרדים את העוברים הפרביוטיים על ידי הוספת מיליליטר של 4 מיליגרם למיליליטר pH 7.0 טריקאין ל-25 מיליליטר של מדיום E3 המכיל את העוברים. מערבלים בעדינות את הצלחת כך שהעוברים מצטברים באמצע.

לאחר מכן באמצעות פיפטת העברת פלסטיק רחבה, לצייר את העוברים בתוך נוזל קטן ככל האפשר. לאחר מכן, להפוך את פיפטה זקוף בעדינות להקפיץ את העוברים כך שהם להתיישב לתחתית מאוד של פיפטה. לאחר מכן מעבירים את העוברים לאליקוט של 1 מיליליטר של אגרוז נקודת התכה נמוכה על ידי נגיעה קלה בקצה פיפטה על פני השטח של האגרוז. יש להשליך את עודפי הנוזלים מהפיפטה ולהשתמש בפיפטה כדי לערבב בעדינות את העוברים באגרוז.

לאחר מכן, עם פיפטה, להעביר את agarose ואת העוברים לבאר של צלחת תחתית זכוכית שש בארות. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בקצה העמסת ג'ל המקובע לקצה מחט מתגרה כדי למקם את העוברים קרוב לזכוכית הכיסוי ובכיוון הרצוי להדמיה. לאחר שהאגרוז שקע ומתווך עם טריקאין נוסף לבארות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי או דיסקוס קונפוקלי הפוך בעל שדה רחב אפיפלואורסצנטי או דיסק מסתובב כדי לקבל תמונות.

עבור שדה ראייה שלם של עובר, השתמש 4x סובייקטיבי. השתמש במטרה של 20x כדי לצלם רקמה ספציפית. עבד את התמונות בהתאם לפרוטוקול הטקסט.