אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

- הכניסו עוברים בעלי עניין לפניל ת'יוריאה, PTU, הפתרון של רינגר לעיכוב היווצרות פיגמנטים, שמתחיל 24 שעות לאחר ההפריה. זה הופך את האנטומיה המתפתחת גלויה יותר, אשר הכרחי עבור הליך זה. מעבירים עובר מורדם טריקאין לתא הדמיה. הניחו מגלשת זכוכית מעליה וצפו בה מתחת למיקרוסקופ. התמקדו באקסון שייפגע, הנראה תחת לייזר של 488 ננומטר מכיוון שהוא מבטא באופן טרנסגנטי GFP.

צלם תמונה מקדימה של האתר. לאחר מכן, הצג את האקסון עם לייזר 910 ננומטר אשר גורם GFP להיות אדום פלואורס. הגדל את עוצמת הלייזר הזה כדי לפגוע באזור המטרה מבלי להשפיע על הרקמה שמסביב. תהליך זה נקרא אקסוטומיה. צלם תמונה חדשה עם הלייזר הראשון כדי לאשר את האקסוטומיה, המופיעה כפסולת מפוזרת. בפרוטוקול הבא נבצע אקסוטומיה של אקסונים חושיים היקפיים בעוברים של דגי זברה באמצעות לייזר דו-פוטוני.

- אם טווח שני פוטונים שנבנה בהתאמה אישית אינו זמין במעבדה שלך, ניתן להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי דו-פוטוני Zeiss 510 גם כדי לנתק אקסונים. נתחיל בהצבת העובר הרכוב על הבמה והבאתו למיקוד באמצעות מטרת מים פי 25. לאחר מכן, הפעל את שני לייזרים פוטון וארגון בסביבה מרובת מסלולים, כך שניתן יהיה לעבור מאחד לשני.

למרות ששני הלייזרים משמשים לגילוי GFP, פליטת שני הפוטונים מומחשת באדום ופליטת לייזר ארגון בירוק על מנת להבדיל בין השניים. השתמש בלייזר ארגון כדי לזהות אקסון לפצוע. תחת הגדרות Z סמן את המקטעים האופטיים הראשון והאחרון, צלם תמונה קונפוקלית וצור הקרנה מרבית של ערימת Z.

כבה את לייזר הארגון והפעל את לייזר שני הפוטון. סרוק בעוצמה של כ-9% שידור כדי לוודא שהאקסון עדיין ממוקד. לחץ על עצור כפתור כדי שכלי החיתוך יהיה זמין. השתמש ב'חתוך' כדי להגדיל את התצוגה של תחום העניין. בדרך כלל אנחנו מתקרבים בערך פי 70. בחר את האזור של האקסון להיפגע והבא את האזור הזה למיקוד. ניתן לבדוק את גודל התצוגה תחת הכרטיסיה מצב.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה ערוצים, שנו את עוצמת שני הפוטון מכ-9% שידור ל-15% עד 30% שידור. כדי להפעיל את ההגדרות החדשות, לחץ על כפתור XY מהיר ולאחר מכן לחץ על עצור במהירות לאחר מכן כדי למנוע נזק עודף. יש לראות את האקסון כפסולת מפוזרת אם ההליך עבד. לבסוף, כדי לוודא שהאקסון אכן ניזוק, חזרו ללייזר ארגון 488 ננומטר. צלמו תמונה קונפוקלית נוספת וצרו הקרנה מרבית של ערימות Z.