מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

- הכניסו שתי נקבות ושני דגים זכרים למיכל רבייה מחולק לילה אחד לפני ההזרקה. למחרת בבוקר, הסירו את המחיצה ותנו לדגים להתרבות עד שתבחינו בביצים בתחתית המיכל. לאסוף את הביצים ולשטוף אותם עם מדיום E3 המכיל methylene כחול, קוטל פטריות. התבוננו בביציות תחת מיקרוסקופ והוציאו ביציות לא מופרות. לביצים לא מופרות יש קרום חלמון שקוף, ואילו לביצים מופרות יש קרום חלמון כהה.

שמרו 10 עוברים בצלוחית פטרי נפרדת כאמצעי ביקורת. בעזרת פיפטת העברה, מיישרים את העוברים לתוך שוקת של צלחת מיקרו-הזרקה בטמפרטורת החדר ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ. דוחפים בעדינות את מחט המיקרו-הזרקה דרך הכוריון לתוך החלמון ומזריקים לאט תרכובת של עניין המכילה סמן כגון פנול אדום. זרימה ציטופלזמית מאפשרת לתרכובת להתפזר לתוך התאים העובריים.

לאחר ההזרקה, לגדל את העוברים בתווך E3 עם מתילן כחול ב 28 מעלות צלזיוס. המשיכו לבדוק את תקינות העוברים. הסר עוברים מתים או מתפתחים באופן חריג ושנה את המדיום מדי יום. בפרוטוקול הבא, נשתמש במיקרו-הזרקה כדי להעביר ריבונוקלאו פרוטאין, או קומפלקס RNP, לעוברים של דגי זברה.

- ראשית, הכינו את נבדקי דגי הזברה לרבייה בלילה שלפני ביצוע הזריקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלבו חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס של שניים לאחד. דגרו על התמיסה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות בזמן שה-Cas9 וה-sgRNA יוצרים קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין. לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של 2.5% תמיסות פנול אדומות במים נטולי RNase מספיקים כדי להשיג נפח סופי של חמישה מיקרוליטר.

כדי להכין את מחט ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית של מילימטר אחד. לאחר מכן לחתוך את קצה מחט זכוכית וכתוצאה מכך עם סכין גילוח כדי לקבל פתח זוויתי. מניחים את המחט במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. באמצעות מיקרוסקופ אור, כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט מזריקה באופן עקבי ננוליטר אחד של תמיסה לצלחת הפטרי.

- לפני ביצוע מיקרו-הזרקה לעובר, תרגלו הכנת מחטים והזרקת עוברי בקרה באמצעות תמיסת צבע בלבד ותיעדו את ההישרדות לאחר 24 שעות של התפתחות. אתה אמור להיות מסוגל להשיג יותר מ 90% הישרדות בהשוואה לביקורת unnjected.

- לאחר מכן, בחרו 10 עד 15 עוברים כאוכלוסיית ביקורת והניחו אותם בצלוחית פטרי נפרדת. בעזרת פיפטת החזרה, רפדו בזהירות את העוברים הנותרים על צלחת הזרקה בטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מזריקים ננוליטר אחד של התמיסה לתוך שק החלמון של כל עובר. לאחר מכן להחזיר את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת ולכסות אותם עם מדיה 1X E3 עם methylene כחול. הניחו את העוברים המוזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן בדוק את העוברים המוזרקים כדי להסיר אנשים מתים או מתפתחים באופן חריג.