אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 3:58 דק׳ • April 30th, 2023
- הכניסו שתי נקבות ושני דגים זכרים למיכל רבייה מחולק לילה אחד לפני ההזרקה. למחרת בבוקר, הסירו את המחיצה ותנו לדגים להתרבות עד שתבחינו בביצים בתחתית המיכל. לאסוף את הביצים ולשטוף אותם עם מדיום E3 המכיל methylene כחול, קוטל פטריות. התבוננו בביציות תחת מיקרוסקופ והוציאו ביציות לא מופרות. לביצים לא מופרות יש קרום חלמון שקוף, ואילו לביצים מופרות יש קרום חלמון כהה.
שמרו 10 עוברים בצלוחית פטרי נפרדת כאמצעי ביקורת. בעזרת פיפטת העברה, מיישרים את העוברים לתוך שוקת של צלחת מיקרו-הזרקה בטמפרטורת החדר ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ. דוחפים בעדינות את מחט המיקרו-הזרקה דרך הכוריון לתוך החלמון ומזריקים לאט תרכובת של עניין המכילה סמן כגון פנול אדום. זרימה ציטופלזמית מאפשרת לתרכובת להתפזר לתוך התאים העובריים.
לאחר ההזרקה, לגדל את העוברים בתווך E3 עם מתילן כחול ב 28 מעלות צלזיוס. המשיכו לבדוק את תקינות העוברים. הסר עוברים מתים או מתפתחים באופן חריג ושנה את המדיום מדי יום. בפרוטוקול הבא, נשתמש במיקרו-הזרקה כדי להעביר ריבונוקלאו פרוטאין, או קומפלקס RNP, לעוברים של דגי זברה.
- ראשית, הכינו את נבדקי דגי הזברה לרבייה בלילה שלפני ביצוע הזריקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלבו חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס של שניים לאחד. דגרו על התמיסה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות בזמן שה-Cas9 וה-sgRNA יוצרים קומפלקס ריבונוקלא
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים