הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron
July 20th, 2010
אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין רקמת מוח של עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני. זה מושג על ידי קיבוע המוח תחילה באמצעות שפע של החיה. השלב השני של ההליך הוא לחתוך את המוח ולעבד את החלקים לאימונוהיסטוכימיה.
השלב השלישי בהליך הוא אוסק, ייבוש והטמעת החלקים. השלב האחרון בהליך הוא חיתוך קטעים דקים במיוחד. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ברזולוציה מרחבית גבוהה, את התפלגות החלבונים השונים באזורים שונים וסוגי תאים שונים של מערכת העצבים המרכזית.
היי, אני מריה טרומבלי מהמעבדה של Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נראה לכם הליך להכנת רקמת מוח של עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות בין מיקרוגליה וסינפסה במהלך ההתפתחות, חווים פלסטיות תלויה והזדקנות.
אז בואו נתחיל. לאחר תיקון מוח העכבר באמצעות זלוף תוך לבבי, יש לתקן אותו בכ-10 מיליליטר פורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שטפו את המוח בארבע מעלות צלזיוס, XPB S3 אחד פעם למשך 10 דקות כל שטיפה באמצעות ויברטור וקר כקרח אחד XPBS מיד חתכו את המוח למקטעים רוחביים של 50 מיקרון.
השתמש במברשת עדינה כדי להעביר חלקים נבחרים לבקבוקון זכוכית מלא בארבע מעלות צלזיוס. XPBS אחד מאחסן חלקים שנותרו ב-Cryoprotectant במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך עד מספר שנים ללא שינוי. עבד מקסימום 10 חלקים צפים בחופשיות לצביעה בכל בקבוקון זכוכית.
השתמש בפיפטה העברה כדי להחליף את ה-XPBS האחד ב-0.1% נתרן בואל הידריד טרי ב-PBS החלף פתרונות במהירות כדי למנוע לחלקים להתייבש. יש לדגור למשך 30 דקות, לשטוף את החלקים עם XPB S3 אחד למשך 10 דקות כל אחד. הקפדה על הסרת כל בלוק הבועות ו-XPBS אחד המכיל 0.5% ג'לטין ו-5% סרום רגיל המתאים לנוגדנים המשניים שישתמשו בהם.
דגירה במשך שעתיים. הוסף את הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת החסימה. דגירה למשך 48 שעות.
שטפו עם XPB S3 אחד פעם אחת למשך 10 דקות. כל דגירה עם נוגדן משני מצומד ביוטין מדולל בתמיסה חוסמת למשך שעתיים. יש לשטוף שלוש פעמים 10 דקות ב-XPBS אחד כמו קודם.
דגירה עם סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז מדולל בתמיסת חסימה למשך שעה. שטפו את החלקים פעם אחת ב-XPBS אחד ופעמיים ב-XTBS אחד למשך 10 דקות כל אחד. כדי לחשוף את התיוג, דגרו קטעי דגירה עם תמיסה טרייה שהוכנה המכילה 0.05% דאב ו-0.01% מי חמצן ב-XTBS אחד.
כאשר הצביעה חומה כהה בעליל או שהתגובה נמשכה חמש דקות, שטפו את החלקים עם XTBS אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת עם XTBS אחד ופעמיים עם PBS אחד למשך 10 דקות כל אחד. במכסה אדים, השתמש במברשת עדינה כדי להעביר חלקים לצלחת תרבית מרובת בארות מלאה ב-XPB אחד.
הסר את ה-PB מבאר אחת בעזרת מברשת דקה כדי לפזר את החלקים באופן שטוח מיד. הוסף תמיסה של 1% אוסמיום טטרוקסיד ב-PB אחד לפני שתעבור להבא, דגור היטב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבר חלקי OSM לבקבוקוני זכוכית.
יש לשטוף עם XPB אחד למשך שלוש פעמים 10 דקות. לייבש את החלקים בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול. ואז תחמוצת פרופילן כמתואר בחלק הטקסט של פרוטוקול זה.
השתמש במברשת דקה שטופה בתחמוצת פרופילן כדי להעביר את החלקים לשרף דופנט טרי. להספגה למשך הלילה, הכניסו את התבשיל המכיל את החלקים לתנור של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי לרכך את השרף, השתמש בשטיפת מברשת עם תחמוצת פרופילן כדי לצפות סרט הטמעת כלור בשכבה דקה של שרף.
העבירו את החלק על הסרט וכסו אותו בסרט הטבעה נוסף באופן שווה חלקו משקלים קלים של כשני גרם מלמעלה כדי לעזור לשרף להתפשט. הניחו לשרף להתפלמר בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 72 שעות בחממה. לאחר פילמור, הסר את המשקולות בשכבה העליונה של סרט ההטבעה מתחת למיקרוסקופ דו-עיני.
בחר אזורי עניין של שניים על שני מילימטר והשתמש בסכין גילוח כדי להוציא אותם מהסרט. סופר הדבק את אזורי העניין לקצות גושי השרף. ריפוי האינקובטור של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.
השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את גוש השרף לצורת טרפז שווה שוקיים, הצורה האופטימלית לשאיבה דקה במיוחד. בעזרת מיקרוטום וסכין זכוכית, הסר את הדבק על פני הרקמה כדי לקבל משטח ישר. ליניקה.
מלאו את סירת סכין הזכוכית במים מזוקקים כפולים וחתכו כמה חלקים בין 0.5 למיקרון אחד. השתמש בלולאה מושלמת כדי להעביר את החלקים על מגלשת סופר כפור. יבש על צלחת חימום של 80 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת עם 0.1% לכחול לואין למשך דקה.
השתמש בבקבוק שפריץ כדי לשטוף עודפי כתם במים מזוקקים כפולים תחת מיקרוסקופ אור, בדוק את החלקים כדי להבחין בין רקמת הכתם לשרף. חותכים חלקים דקים למחצה עד שהגבול בין רקמה לשרף מגיע בערך לאמצע הקטע. החלף את סכין הזכוכית בסכין יהלום ומלא את הסירה במים מזוקקים כפולים.
חותכים כסף לכסף זהב דק במיוחד. חתך בעובי 60 עד 80 ננומטר. השתמש בפינצטה הפוכה עדינה כדי לאסוף בזהירות את החלקים על רשתות רשת נחושת.
יבש את הרשתות על נייר סינון כדי לשפר את הניגודיות. השתמש בפינצטה הפוכה עדינה כדי להעביר רשת לטיפה של ציטראט עופרת למשך שתי דקות. שטפו בעדינות את הרשת על ידי טבילה בשלוש אמבטיות רצופות של מים מזוקקים כפולים.
יבש את הרשת על נייר פילטר אחסן בקופסת רשת לבדיקה מאוחרת יותר במיקרוסקופ האלקטרונים. בחנו רשתות במיקרוסקופ האלקטרונים כדי להמחיש את הצביעה החיסונית, אך גם את המורפולוגיה של אלמנטים תאיים. הם אברונים תוך-תאיים ומערכות היחסים שלהם זה עם זה.
כאן, צביעה חיסונית מייצגת עבור IBA 1 מוצגת ברמה מיקרוסקופית קלה. ההתפלגות התאית של IBA 1 מוגבלת למיקרוגליה, מה שמאשר את הספציפיות שלה ברמה המיקרוסקופית של האלקטרון. IBA one, microglial peric carion מוכתם חיסוני ותהליכים נראים לעין.
צביעת האימונופרוקסידאז DAB מופיעה כמשקע צפוף אלקטרונים. דוגמאות אחרות ל-IBA one, תהליכי מיקרוגליאה מוכתמים במערכת החיסון מציגות גדלים וצורות שונות. הגדלה גבוהה יותר חושפת אברונים תוך-תאיים שונים בתוך אחד מתהליכי המיקרוגליה וגם את היחסים האולטרה-מבניים בין תהליך מיקרוגליאלי אחר לבין אלמנטים סמוכים של גלולת נוירו, כולל סינפסות.
זה עתה הראינו לכם כיצד להכין רקמת מוח של עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעקוב בקפדנות אחר כל השלבים ולתפעל את רקמת המוח בעדינות. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את השלבים להכנת רקמת מוח עכבר למיקרוסקופיה אלקטרונית אימונולוגית. הוא כולל השקיה דרך הלב, חיתוך מוח, וצביעה אימונופראוקסידאזית.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- הבנת חלוקת חלבונים במערכת העצבים המרכזית חיונית למחקר מדעי המוח.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונולוגית מספקת תמונות עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
- הכנה נכונה של רקמת המוח חיונית לתוצאות מדויקות.
- פרוטוקול זה מיועד לחוקרים העובדים עם מודלים של עכברים.
מטרת המחקר
- להכין רקמת מוח עכבר לבחינה מפורטת.
- להמחיש את חלוקת החלבונים באזורי מוח שונים.
- לשפר את ההבנה של מבנים תאיים במערכת העצבים המרכזית.
שיטות בשימוש
- השקיה דרך הלב לקיבוע המוח.
- חיתוך המוח לצורך אימונוהיסטוכימיה.
- הטמעה והתייבשות של חלקי המוח.
- חיתוך חלקים דקים במיוחד לצורך מיקרוסקופיה אלקטרונית.
תוצאות עיקריות
- הכנת רקמת מוח מוצלחת למיקרוסקופיה אלקטרונית אימונולוגית.
- הושגו תמונות ברזולוציה גבוהה המראות חלוקת חלבונים.
- הוכחה ליעילות הפרוטוקול המתואר.
- הושגו תובנות לגבי מבנים תאיים במערכת העצבים המרכזית.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל להכנת רקמת מוח עכבר.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונולוגית יכולה לחשוף לוקליזציה מפורטת של חלבונים.
- שיטה זו יכולה ליישם על מחקרים שונים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution visualization of protein localization in mouse brain tissue, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. By combining immunocytochemistry with transmission electron microscopy, researchers can assess subcellular distribution of therapeutic targets with precision, informing early-stage hypothesis testing and portfolio prioritization. The method enhances predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing protein expression in specific neuronal and glial compartments.
- Operational Value: Provides ultrastructural confirmation of antibody specificity and target engagement in defined cell types.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving intracellular organelle associations and synaptic relationships of target proteins.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible tissue preparations suitable for quantitative immunohistochemical screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of protein density and ultrastructural localization in dendrites, axons, and synapses.
- Platform Reuse: Establishes a validated workflow for evaluating target distribution across brain regions and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates examination of target alterations in neurodegenerative and neurodevelopmental models.
- Translational Continuity: Bridges molecular findings from discovery to ultrastructural validation in preclinical systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by revealing off-target binding or unexpected cellular localization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through preclinical validation, enabling iterative refinement of therapeutic candidates based on subcellular protein distribution data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing target expression in microglia, astrocytes, neurons, and subcellular domains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunohistochemical outputs for comparing target engagement across conditions.
- Analytics: Provides high-resolution spatial readouts that help teams correlate protein localization with functional outcomes.
- Translational Research: Connects in vitro findings to intact tissue architecture, supporting biomarker alignment and mechanistic validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for CNS target characterization across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and clarification of pathway involvement.
- Operational Value: Standardization of tissue preparation, reproducibility across sections, and scalability for multi-target screening.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through early de-risking, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated subcellular expression patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion fixation, immunohistochemistry, and electron microscopy techniques.
- Depends on access to microtomes, ultramicrotomes, and transmission electron microscopes.
- Necessitates standardization of antibody validation, blocking conditions, and DAB reaction controls across teams.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, developmental stages, and disease models.
- Limited by tissue accessibility, fixation artifacts, and the need for meticulous handling to preserve ultrastructure.
