Name: הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למד הכנת רקמות מוח עכבר למיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. הפרוטוקול כולל פרפוזיה טרנסקרדיאלית, חיתוך אולטרה-דק וצביעת immunoperoxidase לזיהוי חלבונים ברזולוציה גבוהה במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שאו-Ming Lu ו האריס א גלברד לשימוש משאבה vibratome peristaltic ו, כמו גם קארן ל בנטלי וגייל שניידר במתקן Core מיקרוסקופ אלקטרונים מחקר של אוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז הרפואי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ-NIH (EY019277), וייטהול Foundation, קרן Wellcome בורוז, ואת פ אלפרד סלואן קרן אל AKM. M.-È.T. ממומנת על ידי דה Fonds en la משוכלל ונדיר סנטה קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט.

1. בעלי חיים זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני זלוף, להכין: - 2 ליטר של חיץ פוספט (PB, 100 מ"מ, pH 7.4) ו - 1 ליטר של סודיום פוספט בופר סליין (PBS; 0.9% NaCl ב 50 מ"מ PB, pH 7.4) במים מזוקקים כפול. חנות PBS ו 1 ליטר של PB ב 4 ° C. אלה ישמשו זלוף והטבעה מראש immunocytochemistry. - 1 ליטר של paraformaldehyde 4.0% (PFA, pH 7.4) מקבע פתרון, אשר יאפשר זלוף של 6 עכברים. לשם כך, לחמם 1 ליטר מתחת למכסה המנוע של PB קטר. שקול 40 גרם של גרגירי paraformaldehyde (PFA) ויוצקים לתוך הפתרון PB כאשר הוא מגיע 60 ° C. כאשר הפתרון הוא ברור, עם PFA נמס לגמרי, להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום זלוף, להכין 500 מ"ל של תמיסת acrolein 3.5% ב PB מתחת למכסה המנוע קטר. ואז, המסנן acrolein 3.5% ו -4.0% באמצעות פתרונות PFA נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרדמה העכבר, להזריק נתרן pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג) תוך הצפק עם מד 27 ½ "מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זלוף, 50 מ"ל של PBS, 75 מ"ל של acrolein, ו -150 מ"ל של PFA יהיה ברצף לעבור למחזור העכבר. כדי להגדיר את המשאבה peristaltic, למלא את צינורות עם PBS ולתקן מד 23 ¾ "מחט פרפר בקצה אחד. לטבול את הקצה השני של הצינור לתוך הפתרון זלוף (PBS, acrolein או PFA). קבע את המהירות של peristaltic משאבת 20-25 mL / min עבור עכברים צעירים ומבוגרים. ברחבי זלוף, בזהירות למנוע בועות אוויר להרכיב בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד העכבר מורדם כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון צביטה זנב, לפני שתמשיך. הנח את החיה מגש לנתיחה ולתקן את הכפות באמצעות קלטת. עם פינצטה ומספריים, לפתוח את עור החזה כדי לחשוף את הלב. כדי למזער איסכמיה, זלוף צריך להיות נכתבו במהירות. גזור לפתוח את אטריום ימין עם מספריים קטנים להתחיל את המשאבה peristaltic. בעוד מחזיק את הלב עם פינצטה, הכנס את המחט לתוך פרפר לשיא של החדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שינוי הפתרון, להפסיק את המשאבה peristaltic, להעביר את צינורות מפתרון אחד למשנהו, ולהפעיל מחדש את המשאבה מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר 150 מ"ל של PFA עבר, להפסיק את המשאבה peristaltic. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את הראש, לפתוח את העור, לשבור את הגולגולת בין העיניים. בעזרת פינצטה קטנה, שבב בזהירות את חתיכות קטנות של הגולגולת עד שהמוח ניתן להסיר בקלות. פוסט לתקן את המוח 2 שעות 4 מעלות צלזיוס PFA. לשטוף 3 פעמים 10 דקות PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחתוך את המוח רוחבי (50 חלקים עבים מיקרומטר) בקרח מקורר PBS באמצעות vibratome. בעזרת מברשת עדינה, העברת חלקים נבחרים immunocytochemistry לתוך בקבוקון זכוכית המכיל PBS. אחסן את החלקים הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס cryoprotectant (30% אתילן גליקול גליצרול ו 30% ב-PBS) עד מספר שנים. </li></ol> 2. טרום הטבעה immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunocytochemistry, קטעים מעובדים בחופשיות צף צלוחיות זכוכית. לאורך כל ההליך, צריך להיזהר לתת חלקים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר את PBS בעזרת פיפטה העברה מיד להחליף עם פתרון חדש של borohydride נתרן 0.1% ב PBS במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות, להסיר את כל הבועות, ו דגירה עבור 2 שעות RT בפתרון חסימת PBS המכיל 0.5% לטין בסרום נורמלי 5% של החיה שבה נוגדנים משני שנוצר (נסיוב עז נורמלית הדוגמה הנוכחית immunostaining-Iba1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 48 שעות עם נוגדן ראשוני חסימת פתרון. עבור immunostaining-Iba1, להשתמש אנטי Iba1 ארנבת הנוגדן (1:1000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של נוגדנים משני מצומדות כדי ביוטין (1:1000) בחסימת פתרון 2 שעות RT. עבור immunostaining-Iba1, השתמש נגד ארנב IgGs עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של peroxidase-streptavidin חזרת (1:1000) בחסימת פתרון לשעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 10 דקות עם טריס / HCl שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ"מ, ה-pH 7.4) 2 פעמים 10 דקות. כדי לחשוף את התיוג, דגירה קטעים עם DAB 0.05% ו 0.01% חמצן ב TBS (פתרון מוכן טרי). כאשר מכתים הוא חום כהה (ראה דוגמה באיור 1), לעצור את התגובה על ידי שטיפה ב TBS. בכל מקרה, בסוף התגובה לאחר למקסימום של 5 דקות. לשטוף חלקים עם כפות 10 דקות עם PB 2 פעמים 10 דקות. </li></ol> 3. עיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך PB בצלחת תרבות multiwell בעזרת מברשת בסדר. הכן 1% tetroxide אוסמיום פתרון PB מתחת למכסה המנוע רותח. הסר PB מבארות הצלחת תרבות להפיץ את הסעיפים שטוח עם מברשת עדינה. סעיפים לטבול מיד אוסמיום 1% למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך צלוחיות זכוכית, לשטוף עם PB 3 פעמים 10 דקות, מייבשים דרך התעמקות 2 דקות לתוך עולה ריכוזי אתנול: 2 פעמים 35%, 1 בכל פעם של 50%, 70%, 80%, 90% ו 95 %, 3 פעמים 100%, ואחריו 3 פעמים פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את שרף Durcupan, לשלב 20 גרם של רכיב, 20 גרם של רכיב ב ', 0.6 גרם של רכיב C, ו - 0.4 גרם של מרכיב D לכוס חד פעמיות, ומערבבים היטב עד שהצבע הופך אחיד, ויוצקים לתוך אלומיניום לשקול צלחת. במידת הצורך, אבני שרף יכול להיות מוכן על ידי שפיכת שרף לתוך הטבעת תבניות תנור ריפוי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מברשת בסדר לשטוף עם פרופילן אוקסיד, להסיר קטעים מתוך תחמוצת פרופילן לטבול לתוך שרף Durcupan הספגה עבור לילה בבית RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשים האלומיניום לשקול מאכל לתוך תנור 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לרכך את שרף. בעזרת מברשת שטפה עם פרופילן אוקסיד, מעיל סרט הטבעה ACLAR בשכבה דקה של שרף, שכב הסעיפים, מכסים עם סרט אחר הטבעה, ובאופן שווה להפיץ משקולות קלות (כ -2 גרם, למשל את פקקי פלסטיק של צלוחיות זכוכית) על גבי לעזור שרף מתפשטת. עבור פילמור שרף, דגירה בתנור למשך 48-72 שעות (ב 55 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פילמור, להסיר את המשקולות אור הסרט הטבעה על החלק העליון של הסעיפים. תחת מיקרוסקופ המשקפת, בחר תחומי עניין מרובע (כ 2x2 מ"מ) ובלו אותם בקפידה מתוך הסרט באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק תחומי עניין בקצה גושי שרף באמצעות דבק מגע מרפא את התנור ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת חתך, חתוך את גוש שרף בצורת טרפז שווה שוקיים עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ultramicrotome וסכין זכוכית, להסיר את דבק שרף על פני השטח של הרקמה. ממלאים את הסירה של סכין זכוכית עם מים מזוקקים כפול לחתוך כמה חצי דקה חלקים (0.5-1 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לשקופית SuperFrost עם לולאה מושלמת. יבש את החלקים על ידי הצבת את השקופית על צלחת חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. מכסים עם כמה טיפות של 0.1% toluidine כחול (borate 2 גרם נתרן ו -0.2 גרם toluidine כחול במים מזוקקים 200 מ"ל כפול) כתם במשך דקה 1. יש לשטוף את הכתם עם עודף מים מזוקקים כפול. בחינת הסעיפים עם מיקרוסקופ אור יאפשר להבחין בין רקמה צבעונית של שרף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים חיתוך עד הגבול בין רקמות שרף מגיע באמצע הקטעים. שים לב כי ההליך הבא דורש הכשרה. החלף את הסכין בכוס עם סכין יהלום ולמלא את הסירה במים מזוקקים כפול. גזור כסף כסף זהב סעיפים Ultrathin (60-80 ננומטר עבה) בזהירות לאסוף אותם על רשת רשתות נחושת באמצעות פינצטה הפוכה בסדר. יבש את רשתות על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר לעומת זאת, בסעיפים Ultrathin יכול להיות מוכתם להוביל ציטראט (citrate 0.03 גרם עופרת 0.1 מ"ל נתרן הידרוקסיד 10N במים מזוקקים 10 מ"ל כפול 1). בעזרת פינצטה הפוכה בסדר, העברת רשת ירידה של ציטרט להוביל במשך 2 דקות. הסר את הרשת בעדינות ולשטוף ב 3 אמבטיות רצופים של מים מזוקקים כפול. לבסוף, לייבש את רשתות על נייר לסנן ולאחסן אותם בתוך קופסת רשת עד בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים (איורים 3-6). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Iba1 מוכתם בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הפצה הסלולר של Iba1 מוגבל microglia, אשר מציג את הספציפיות של immunostaining. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור Toluidine כחול מוכתם חצי דקה בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הערה הגבול בין רקמות שרף שבו immunostaining יופיע אינטנסיבי ביותר מיקרוסקופ אלקטרונים. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור Ultrathin סעיף מראה Iba1-immunopositive perikaryon microglial ותהליכים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. אלמנטים מבניים Iba1 חיובי מוכרים על ידי המשקע אימונו-DAB אלקטרונים צפופה שלהם. בר סולם = 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> 4. איור Ultrathin סעיף הצגת Iba1-immunopositive תהליכים microglial גדלים וצורות שונים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. בר סולם = 2 מיקרומטר. ה 5 "/&gt; איור 5. סעיף Ultrathin מראה בהגדלה גבוהה תהליך Iba1 חיובי microglial מ איור 4, המאפשר זיהוי של אברונים תאיים שלה. בר סולם = 1 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Ultrathin סעיף חושף בהגדלה גבוהה יותר את היחסים בין ultrastructural Iba1 תהליך חיובי microglial אלמנטים הסמוך neuropil כולל סינפסות. בר סולם = 1μm.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן יש לנו תיאר פרוטוקול להכנת רקמת המוח העכבר עבור מיקרוסקופיה immunoelectron המספק פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical, כאשר הנהלים מבוצעים בקפדנות. בשילוב עם TEM, שיטה זו מאפשרת להבחין בין אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים זיהוי. בפרט, מכתים אימונו-DAB של Iba1 מאפשר לזהות perikarya microglial ותהליכים, בתוך neuropil, כמו גם לנתח מורפולוגיה שלהם, אברונים תאיים...

* תמיד צריך לעבוד מתחת למכסה המנוע קטר ללבוש כפפות בעת טיפול nitrile acrolein, paraformaldehyde ו אוסמיום ויש גם להשליך את הפסולת שלהם כראוי.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית immunoelectron

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הוא מאוד שימושי עבור חזותי microglial, תאים subcellular oligodendrocytic, astrocytic, ואת עצבי (דנדריט, עמוד השדרה דנדריטים, האקסון, האקסון לטרמינל, perikaryon), כמו גם אברונים תאיים שלהם cytoskeleton, במערכת העצבים המרכזית ברזולוציה מרחבית גבוהה. בשילוב עם TEM, טרום הטבעה immunocytochemistry מאפשר את האפליה של אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים הזדהות (למשל, microglial perikarya ותהליכים, כאשר באמצעות נוגדן כנגד סמן microglia ספציפית Iba1 (סידן מיונן מחייב מתאם המולקולה 1, כפי שהוצגו כאן)), זיהוי תוכן הנוירוטרנסמיטר של אלמנטים הסלולרי (למשל, serotonergic) ולוקליזציה ultrastructural שלהם של חלבונים מסיסים או קרום הנכנס (למשל, 5 ו HT1A EphA4 קולטנים). כאן אנו מתארים פרוטוקול זלוף transcardiac של עכברים עם acrolein מקבע, הסרת חתך של המוח, כמו גם אימונו-diaminobenzidine (DAB) מכתים, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של בסעיפים המוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן לבדיקה עם TEM. כאשר מבוצע בקפידה, טכניקה זו מהווה פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical.

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור מעבר (TEM) שימושית ביותר להדמיה של מדורים תת-תאיים של מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ונוירונים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. זאת על ידי קיבוע ראשוני של המוח באמצעות פרפוזיה של בעל החיים. השלב השני של הפרוצדורה הוא חיתוך המוח ועיבוד הנתחים לצורך אימונוהיסטוכימיה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קיבוע, דהידרטציה ושיקום של החתכים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא חיתוך של חתכים דקים מאוד. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ברזולוציה מרחבית גבוהה את ההתפלגות של חלבונים שונים בתוך אזורים וסוגי תאים שונים של מערכת העצבים המרכזית.שלום, אני מריה טרומבלי ממעבדת Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נדגים לכם פרוצדורה להכנת רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציות בין מיקרוגליה לסינפסות במהלך התפתחות, פלסטיות תלוית-ניסיון והזדקנות.בואו נתחיל. לאחר קיבוע מוח העכבר באמצעות פרפוזיה תוך-לבבית, קבעו אותו שנית ב-10 מיליליטר בקירוב של פורמלהיד בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שטפו את המוח ב-1X PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה באמצעות ויברטור ו-1X PBS קר מאוד; חתכו מיד את המוח לחתכים רוחביים בעובי 50 מיקרון.השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר חתכים נבחרים למבחנת זכוכית מלאה ב-4 °C XPBS. את שאר החתכים שמרו בחומר קריו-פרוטקטורי ב-20- °C למשך עד מספר שנים ללא שינוי. עבדו מקסימום 10 חתכים צפים בחופשיות לצביעה בכל מבחנת זכוכית.השתמשו בפיפטת העברה כדי להחליף את ה-1X PBS ב-0.1% Sodium borohydride טרי ב-PBS; החליפו את התמיסות במהירות כדי למנוע את התייבשות החתכים. דגרו למשך 30 דקות, ושטפו את החתכים עם 1X PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. הקפידו להסיר את כל הבועות, והעבירו ל-1X PBS המכיל 0.5% gelatin ו-5% normal serum המתאים לנוגדן המשני שבו ייעשה שימוש.דגרו למשך שעתיים. הוסיפו את הנוגדן הראשוני המדולל בתמיסת החסימה. דגרו למשך 48 שעות.שטפו עם 1X PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות. דגרו כל דגימה עם נוגדן שני מצומד לביוטין, המדולל בתמיסת חסימה, למשך שעתיים. שטפו שלוש פעמים למשך 10 דקות ב-1X PBS כפי שבוצע קודם לכן.דגרו עם streptavidin horseradish peroxidase המדולל בתמיסת חסימה למשך שעה אחת. שטפו את החתכים פעם אחת ב-one XPBS ופעמיים ב-one XTBS למשך 10 דקות כל פעם. כדי להוות את הסימון, דגרו את החתכים עם תמיסה שהוכנה טריה המכילה 0.05%dab ו-0.01%hydrogen peroxide ב-one XTBS.כאשר הצביעה הופכת לחומית כהה באופן נראה לעין או כאשר התגובה נמשכה חמש דקות, שטפו את הפרוסות ב-XTBS אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם XTBS אחד ופעמיים עם 1x PB למשך 10 דקות בכל פעם. תחת מapay מנדף, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את הפרוסות לתוך פלטת תרבית רב-בארים מלאה ב-1XPB.הסר את ה-PB מבאר אחת באמצעות מברשת עדינה כדי לפרוס את החתכים באופן שטוח באופן מיידי. הוסף תמיסה של 1% osmium tetroxide ב-one x PB לפני המעבר לבאר הבאה, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבר את חתכי ה-OSM לבקבוקוני זכוכית.שטפו פעם אחת עם XPB למשך שלוש פעמים של 10 דקות. ייבשו את החתכים בריכוזים עולים של אתנול. לאחר מכן, השתמשו בפרופילן אוקסיד כפי שמתואר בחלק הטקסטואלי של פרוטוקול זה.השתמשו במברשת עדינה שנשטפה ב-propylene oxide כדי להעביר את החתכים לתוך שרף dupant שהוכן טרי. לצורך חדירה (impregnation) של השבבים במהלך הלילה, הכניסו את הצלחת המכילה את החתכים לתנור בטמפרטורה של 55 degree Celsius למשך 10 דקות. כדי לרכך את השרף, השתמשו במברשת שנשטפה ב-propylene oxide כדי לצפות סרט השחלה של chlor בשכבה דקה של שרף.העבירו את החתך אל סרט ההטמעה וכסו אותו בסרט הטמעה נוסף. פזרו באופן אחיד משקולות קלות של כ-2g מעל כדי לסייע לפריסת שרף המטמיה. אפשרו לשרף לעבור פולימריזציה בטמפרטורה של 55 °C למשך 48 עד 72 שעות באינקובטור. לאחר הפולימריזציה, הסירו את המשקולות משכבת סרט ההטמעה העליונה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.בחרו אזורי עניין בגודל שני על שני מילימטרים והשתמשו בלהב תער כדי לחתוך אותם מהסרט. הדביקו את אזורי העניין לקצותיהם של בלוקי שרף באמצעות דבק מהיר (Super Glue). בצעו הקשיה באינקובטור בטמפרטורה של 55 °C למשך שעה אחת.השתמשו בלהב תער כדי לקצץ את בלוק הרזין לצורת טרפז שווה שוקיים, הצורה האופטימלית לשאיבה דקה במיוחד. באמצעות מיקרוטום וסכין זכוכית, הסירו את הדבק מפני השאריות של הרקמה כדי לקבל פני שטח שטוחים. לצורך שאיבה.מלא את סירת סכין הזכוכית במים מזוקקים פעמיים וחתך מספר חתכים בעובי שבין 0.5 למיקרון אחד. השתמש בלולאה מושלמת (perfect loop) כדי להעביר את החתכים לשקופית super frost. ייבש על פלטה מחממת בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך דקה אחת, וצבע עם tolluine blue בריכוז של 0.1% למשך דקה אחת.השתמשו בבקבוק התזה כדי לשטוף שאריות צבע באמצעות מים מזוקקים פעמיים. תחת מיקרוסקופ אור, בחנו את החתכים כדי להבדיל בין הרקמה הצבועה לבין השרף. חתכו חתכים דקים למחצה עד שהגבול בין הרקמה לשרף מגיע בקירוב למרכז החתך. החליפו את סכין הזכוכית בסכין יהלום ומלאו את מיכל הדגימה במים מזוקקים פעמיים.בצעו חיתוך של הכסף לאולטרה-דק (ultra thin) באמצעות סכין כסף-זהב. חתכו חתכים בעובי של 60 עד 80 ננומטרים. השתמשו בפינצטה הפוכה עדינה כדי לאסוף בזהירות את החתכים על גבי רשתות נחושת.ייבשו את הרשתות על נייר סינון כדי לשפר את הניגודיות. השתמשו בפינצטה עדינה הפוכה כדי להעביר רשת לטיפה של lead citrate למשך שתי דקות. שטפו בעדינות את הרשת על ידי טבילה בשלושה רחצאים עוקבים של מים מזוקקים פעמיים.ייבשו את הרשת על נייר סינון ואחסנו אותה בקופסת רשתים לצורך בדיקה מאוחרת במיקרוסקופ אלקטרונים. בחנו את הרשתות במיקרוסקופ אלקטרונים כדי להדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית, וכן את המורפולוגיה של הרכיבים התאיים, האורגנלות התוך-תאיות והקשרים ביניהן.כאן מוצגת צביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת עבור IBA1 ברמת המיקרוסקופ האור. ההפצה התאית של IBA1 מוגבלת למיקרוגליה, מה שמאשר את הספציפיות שלה ברמת המיקרוסקופ האלקטרוני. ניתן לראות גופי תא של מיקרוגליה וזיזים הצבועיים ב-IBA1.צביעת האימונו-פרוקסידאז DAB מופיעה כמשקב דחוס אלקטרונית. דוגמאות נוספות של זרועות מיקרוגליה שנצבעו אימונו-היסטוכימיות עבור IBA1 מציגות גדלים וצורות שונות. הגדלה גבוהה יותר חושפת אברונים תו-תאיים שונים בתוך אחת מזרועות המיקרוגליה, וכן את הקשרים העל-מבניים בין זרוע מיקרוגליה אחרת לבין אלמנטים סמוכים של ה-neuropil, כולל סינפסים.הראינו לכם כעת כיצד להכין רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד על ביצוע מדויק של כל השלבים ולטפל ברקמת המוח בעדינות. זהו כל התהליך.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של סיבים כולינרגיים בגרעין הבסיסי של אזור מיינרט של מקטעי מוח של עכבר. הקטעים נחסמים ומטופלים בראשוני כנגד כולין אצטילטרנספראז, ואחריו נוגדנים משניים ביוטיניליים. מתווספים קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים משניים, ואחריהם המצע הכרומוגני. לאחר מכן החלקים מיובשים ומורכבים לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי עצב בגרעין הבסיסי של מיינר במוח העכבר

מקור: Kummari, E., et. al., לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה - הדגמה של בידוד של נוירונים בודדים של דופמין וכל האזור הטגמנטלי הגחוני., J. Vis. Exp. (2015) בסרטון זה, אנו מדגימים את פרוטוקול האימונוהיסטוכימיה עבור נוירונים של דופמין בקטעי רקמת המוח עבור מיקרודיסקציה של לכידת לייזר לאחר מכן.

אימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמת מוח של עכבר למיקוד נוירונים של דופמין

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מקור: Louth, E. L., et al. הדמיית נוירונים בתוך מקטעי מוח עבים בשיטת גולגי-קוקס. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדמיית נוירונים בקטע מוח עבה מוכתם גולגי-קוקס על ידי הגדרת גבולות מיקוד עליונים ותחתונים ולכידת תמונות חופפות. מיקומים מרובים מצולמים כדי להבטיח הקרנות עצביות מפורטות, המשולבות ליצירת ייצוג תלת מימדי.

הדמיה מיקרוסקופית של תאי עצב בקטע מוח של עכבר באמצעות צביעה מתכתית של גולגי-קוקס

במאמר זה אנו מתארים את ההליך ניסיוני המלא לשחזר, עם רזולוציה גבוהה, האנטומיה מוח הקנס של מוח עכבר שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול המתואר כולל הכנת מדגם וסליקה, דגימת הרכבה עבור הדמיה, שלאחר עיבוד נתונים והדמיה רב היקף.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC).  השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

למד הכנת רקמות מוח עכבר למיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. הפרוטוקול כולל פרפוזיה טרנסקרדיאלית, חיתוך אולטרה-דק וצביעת immunoperoxidase לזיהוי חלבונים ברזולוציה גבוהה במערכת העצבים המרכזית.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

גלה סרטונים נוספים