הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron
20 ביולי 2010
אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. זאת על ידי קיבוע ראשוני של המוח באמצעות פרפוזיה של בעל החיים. השלב השני של הפרוצדורה הוא חיתוך המוח ועיבוד הנתחים לצורך אימונוהיסטוכימיה.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קיבוע, דהידרטציה ושיקום של החתכים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא חיתוך של חתכים דקים מאוד. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ברזולוציה מרחבית גבוהה את ההתפלגות של חלבונים שונים בתוך אזורים וסוגי תאים שונים של מערכת העצבים המרכזית.
שלום, אני מריה טרומבלי ממעבדת Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נדגים לכם פרוצדורה להכנת רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציות בין מיקרוגליה לסינפסות במהלך התפתחות, פלסטיות תלוית-ניסיון והזדקנות.
בואו נתחיל. לאחר קיבוע מוח העכבר באמצעות פרפוזיה תוך-לבבית, קבעו אותו שנית ב-10 מיליליטר בקירוב של פורמלהיד בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שטפו את המוח ב-1X PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה באמצעות ויברטור ו-1X PBS קר מאוד; חתכו מיד את המוח לחתכים רוחביים בעובי 50 מיקרון.
השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר חתכים נבחרים למבחנת זכוכית מלאה ב-4 °C XPBS. את שאר החתכים שמרו בחומר קריו-פרוטקטורי ב-20- °C למשך עד מספר שנים ללא שינוי. עבדו מקסימום 10 חתכים צפים בחופשיות לצביעה בכל מבחנת זכוכית.
השתמשו בפיפטת העברה כדי להחליף את ה-1X PBS ב-0.1% Sodium borohydride טרי ב-PBS; החליפו את התמיסות במהירות כדי למנוע את התייבשות החתכים. דגרו למשך 30 דקות, ושטפו את החתכים עם 1X PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. הקפידו להסיר את כל הבועות, והעבירו ל-1X PBS המכיל 0.5% gelatin ו-5% normal serum המתאים לנוגדן המשני שבו ייעשה שימוש.
דגרו למשך שעתיים. הוסיפו את הנוגדן הראשוני המדולל בתמיסת החסימה. דגרו למשך 48 שעות.
שטפו עם 1X PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות. דגרו כל דגימה עם נוגדן שני מצומד לביוטין, המדולל בתמיסת חסימה, למשך שעתיים. שטפו שלוש פעמים למשך 10 דקות ב-1X PBS כפי שבוצע קודם לכן.
דגרו עם streptavidin horseradish peroxidase המדולל בתמיסת חסימה למשך שעה אחת. שטפו את החתכים פעם אחת ב-one XPBS ופעמיים ב-one XTBS למשך 10 דקות כל פעם. כדי להוות את הסימון, דגרו את החתכים עם תמיסה שהוכנה טריה המכילה 0.05%dab ו-0.01%hydrogen peroxide ב-one XTBS.
כאשר הצביעה הופכת לחומית כהה באופן נראה לעין או כאשר התגובה נמשכה חמש דקות, שטפו את הפרוסות ב-XTBS אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם XTBS אחד ופעמיים עם 1x PB למשך 10 דקות בכל פעם. תחת מapay מנדף, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את הפרוסות לתוך פלטת תרבית רב-בארים מלאה ב-1XPB.
הסר את ה-PB מבאר אחת באמצעות מברשת עדינה כדי לפרוס את החתכים באופן שטוח באופן מיידי. הוסף תמיסה של 1% osmium tetroxide ב-one x PB לפני המעבר לבאר הבאה, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבר את חתכי ה-OSM לבקבוקוני זכוכית.
שטפו פעם אחת עם XPB למשך שלוש פעמים של 10 דקות. ייבשו את החתכים בריכוזים עולים של אתנול. לאחר מכן, השתמשו בפרופילן אוקסיד כפי שמתואר בחלק הטקסטואלי של פרוטוקול זה.
השתמשו במברשת עדינה שנשטפה ב-propylene oxide כדי להעביר את החתכים לתוך שרף dupant שהוכן טרי. לצורך חדירה (impregnation) של השבבים במהלך הלילה, הכניסו את הצלחת המכילה את החתכים לתנור בטמפרטורה של 55 degree Celsius למשך 10 דקות. כדי לרכך את השרף, השתמשו במברשת שנשטפה ב-propylene oxide כדי לצפות סרט השחלה של chlor בשכבה דקה של שרף.
העבירו את החתך אל סרט ההטמעה וכסו אותו בסרט הטמעה נוסף. פזרו באופן אחיד משקולות קלות של כ-2g מעל כדי לסייע לפריסת שרף המטמיה. אפשרו לשרף לעבור פולימריזציה בטמפרטורה של 55 °C למשך 48 עד 72 שעות באינקובטור. לאחר הפולימריזציה, הסירו את המשקולות משכבת סרט ההטמעה העליונה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.
בחרו אזורי עניין בגודל שני על שני מילימטרים והשתמשו בלהב תער כדי לחתוך אותם מהסרט. הדביקו את אזורי העניין לקצותיהם של בלוקי שרף באמצעות דבק מהיר (Super Glue). בצעו הקשיה באינקובטור בטמפרטורה של 55 °C למשך שעה אחת.
השתמשו בלהב תער כדי לקצץ את בלוק הרזין לצורת טרפז שווה שוקיים, הצורה האופטימלית לשאיבה דקה במיוחד. באמצעות מיקרוטום וסכין זכוכית, הסירו את הדבק מפני השאריות של הרקמה כדי לקבל פני שטח שטוחים. לצורך שאיבה.
מלא את סירת סכין הזכוכית במים מזוקקים פעמיים וחתך מספר חתכים בעובי שבין 0.5 למיקרון אחד. השתמש בלולאה מושלמת (perfect loop) כדי להעביר את החתכים לשקופית super frost. ייבש על פלטה מחממת בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך דקה אחת, וצבע עם tolluine blue בריכוז של 0.1% למשך דקה אחת.
השתמשו בבקבוק התזה כדי לשטוף שאריות צבע באמצעות מים מזוקקים פעמיים. תחת מיקרוסקופ אור, בחנו את החתכים כדי להבדיל בין הרקמה הצבועה לבין השרף. חתכו חתכים דקים למחצה עד שהגבול בין הרקמה לשרף מגיע בקירוב למרכז החתך. החליפו את סכין הזכוכית בסכין יהלום ומלאו את מיכל הדגימה במים מזוקקים פעמיים.
בצעו חיתוך של הכסף לאולטרה-דק (ultra thin) באמצעות סכין כסף-זהב. חתכו חתכים בעובי של 60 עד 80 ננומטרים. השתמשו בפינצטה הפוכה עדינה כדי לאסוף בזהירות את החתכים על גבי רשתות נחושת.
ייבשו את הרשתות על נייר סינון כדי לשפר את הניגודיות. השתמשו בפינצטה עדינה הפוכה כדי להעביר רשת לטיפה של lead citrate למשך שתי דקות. שטפו בעדינות את הרשת על ידי טבילה בשלושה רחצאים עוקבים של מים מזוקקים פעמיים.
ייבשו את הרשת על נייר סינון ואחסנו אותה בקופסת רשתים לצורך בדיקה מאוחרת במיקרוסקופ אלקטרונים. בחנו את הרשתות במיקרוסקופ אלקטרונים כדי להדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית, וכן את המורפולוגיה של הרכיבים התאיים, האורגנלות התוך-תאיות והקשרים ביניהן.
כאן מוצגת צביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת עבור IBA1 ברמת המיקרוסקופ האור. ההפצה התאית של IBA1 מוגבלת למיקרוגליה, מה שמאשר את הספציפיות שלה ברמת המיקרוסקופ האלקטרוני. ניתן לראות גופי תא של מיקרוגליה וזיזים הצבועיים ב-IBA1.
צביעת האימונו-פרוקסידאז DAB מופיעה כמשקב דחוס אלקטרונית. דוגמאות נוספות של זרועות מיקרוגליה שנצבעו אימונו-היסטוכימיות עבור IBA1 מציגות גדלים וצורות שונות. הגדלה גבוהה יותר חושפת אברונים תו-תאיים שונים בתוך אחת מזרועות המיקרוגליה, וכן את הקשרים העל-מבניים בין זרוע מיקרוגליה אחרת לבין אלמנטים סמוכים של ה-neuropil, כולל סינפסים.
הראינו לכם כעת כיצד להכין רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד על ביצוע מדויק של כל השלבים ולטפל ברקמת המוח בעדינות. זהו כל התהליך.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את השלבים להכנת רקמת מוח של עכבר עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית. הוא כולל פרפוזיה דרך הלב (transcardiac perfusion), חיתוך של המוח וצביעת אימונו-פרוקסידאז.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- הבנת התפלגות החלבונים במערכת העצבים המרכזית היא קריטית למחקר בתחום מדעי המוח.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית מספקת תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה.
- הכנה נכונה של רקמת מוח חיונית לקבלת תוצאות מדויקות.
- פרוטוקול זה תוכנן עבור חוקרים העובדים עם מודלים של עכברים.
מטרת המחקר
- להכנת רקמת מוח של עכבר לבדיקה מפורטת.
- להדמיית פיזורם של חלבונים באזורי מוח שונים.
- לשיפור ההבנה של מבנים תאיים במערכת העצבים המרכזית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרפוזיה טרנס-קרדיאלית לקיבוע המוח.
- חיתוך של המוח עבור אימונוהיסטוכימיה.
- הטמעה והתייבשות של חיתוכי מוח.
- חיתוך של שכבות דקיקות למיקרוסקופיה אלקטרונית.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של רקמת מוח עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית.
- השגת תמונות ברזולוציה גבוהה המראות את התפלגות החלבונים.
- הדגמת יעילותו של הפרוטוקול המתואר.
- מתן תובנות לגבי מבנים תאיים במערכת העצבים המרכזית.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל להכנת רקמת מוח של עכבר.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונוהיסטוכימית יכולה לחשוף לוקליזציה מפורטת של חלבונים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרי מדעי המוח שונים.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של לוקליזציית חלבונים ברקמת מוח של עכבר, ובכך תומך בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות במדעי העצבים. באמצעות שילוב של אימונוציטוכימיה עם מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM), חוקרים יכולים להעריך את ההפצה התת-תאית של מטרות טיפוליות בדיוק רב, דבר המסייע בבחינת השערות בשלבים מוקדמים ובתעדוף תיקי פיתוח. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים של מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של ביטוי חלבונים בתאים עצביים ובמבני גליה ספציפיים.
- ערך תפעולי: מספק אישור אולטרה-מבני לספציפיות של הנוגדן ולקישור למטרה בסוגי תאים מוגדרים.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי פתרון הקשרים בין אבנים תאיות פנימיות ומערכות יחסים סינפטיות של חלבוני המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת תכשירי רקמה סטנדרטיים וניתנים לשחזור המתאימים לסריקה אימונוהיסטוכימית כמותית.
- פלט כמותי: מאפשרת מדידה של צפיפות חלבונים ומיקום אולטרה-מבני בדנדריטים, באקסונים ובסינפסים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מבססת תהליך עבודה מתוקף להערכת התפלגות מטרות באזורי מוח שונים ובמודלים של מחלות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מאפשר בדיקה של שינויים במטרה במודלים של מחלות ניוורו-דגנרטיביות וניוורו-התפתחותיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים מולקולריים משלב הגילוי ועד לתיקוף אולטרה-מבני במערכות פרה-קליניות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go באמצעות חשיפת קישור לאתרים שאינם המטרה (off-target) או לוקליזציה תאית בלתי צפויה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת שכלול איטרטיבי של מועמדים טיפוליים בהתבסס על נתוני התפלגות חלבונים תת-תאיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי חשיפת ביטוי של מטרות במיקרוגליה, באסטרוציטים, בנוירונים ובמיקומים סוב-תאיים.
- סריקה: מספק תוצרים אימונוהיסטוכימיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואת מעורבות המטרה בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספק קריאות מרחביות ברזולוציה גבוהה המסייעות לצוותים לבצע קורלציה בין לוקליזציה של חלבונים לבין תוצאות פונקציונליות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למבנה רקמה שלם, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים ובתיקוף מנגנוני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצביון של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) במגוון פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית והבהרת מעורבות של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת רקמות, הדירות בין חתכים ויכולת הרחבה לסריקת מטרות מרובות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת והפחתת הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון על בסיס דפוסי ביטוי תת-תאיים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של קיבוע בפרפוזיה, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית.
- תלוי בגישה למיקרוטומים, אולטרה-מיקרוטומים ומיקרוסקופי אלקטרונים בשידור (transmission electron microscopes).
- מחייב סטנדרטיזציה של תיקוף נוגדים, תנאי חסימה (blocking) ובקרות לתגובת DAB בין הצוותים השונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור אזורי מוח שונים, שלבים התפתחותיים ומודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי נגישות הרקמה, ארטיפקטים של קיבוע והצורך בטיפול קפדני לשמירה על האולטרה-סטרוקטורה.
