טרנסדוקציה לסימון תאי גידול PDX: החדרת סמן פלואורסצנטי המבטא Lentivirus לתא הגידול במבחנה

Lentivirus הוא רטרווירוס המכיל חומר גנטי RNA. וירוס זה מספק שיטה יעילה ויציבה להחדרת טרנסגנים לשורות תאים סרטניים. התחל על ידי הוספת neuraminidase לצינור המכיל Lentivirus המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP. שמור את הצינור על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להגביר את יעילות הקישור של הנגיף.

לאחר מכן, צנטריפוגה צינור המכיל תרחיף תאי גידול כדי ליצור כדור. הוסף מדיה ממוספירה המכילה פוליברן כדי להשעות מחדש את התאים. פוליברן הוא פולימר קטיוני המגביר את יעילות הזיהום הלנטיויראלי. כעת יש לצלחת את המספר האופטימלי של תאי גידול לכל באר בצלחת תרבית רקמה של שש בארות. מוסיפים את הכמות הנדרשת של Lentivirus לכל באר של צלחת התרבית.

מערבלים את הצלחת כדי לערבב את התוכן, ושומרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 96 שעות עם אספקה רציפה של פחמן דו חמצני. הלנטיוירוס נכנס לתא ומשחרר RNA. התעתיק ההפוך הנגיפי ממיר את הרנ"א לדנ"א דו-גדילי המשתלב בגנום המארח. הניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועקבו אחר תאים להתמרה מוצלחת. התאים המומרים פלואורסים עקב ביטוי GFP.

בפרוטוקול לדוגמה, נבצע התמרה של תאי גידול מנותקים PDX עם וקטורים Lentiviral.

כדי להתמיר את תאי הגידול, צנטריפוגה את התאים המבודדים להשעיה בשני מיליליטר של תווך ממוספירה. לאחר הספירה, צנטריפוגה את התאים שוב להשעות את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום ממוספירה, בתוספת 20 מיקרוליטר של פוליברן. לאחר מכן, צלחת 2 כפול 10 עד תאי הגידול החמישי קיימא לכל באר בהיצמדות נמוכה במיוחד שש צלחת תרבית רקמה באר וחלקיקים Lentiviral לתאים במכפלה של זיהום של 10.

מערבלים את הצלחת כדי לערבב את הנגיף עם התאים ולדגור על התרביות המשותפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך עד 96 שעות, תוך הוספת 500 מיקרוליטר של מדיום ממוספירה טרי לאחר 24 השעות הראשונות. כאשר לפחות 10% מהתאים הם חיוביים ל-GFP, העבירו את התאים המומרים מבאר אחת לפחות לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר על קרח ושטפו את הבאר במיליליטר אחד של מדיום ממוספירה.

אגרו את השטיפה עם התאים וצנטריפוגו את תאי הגידול ב -10 מיליליטר של HBSS בתוספת HEPES. לבסוף, להשהות מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של תמצית מטריצת מרתף על קרח ולטעון את התאים המשובצים לתוך מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר להשתלה מחדש.