דיסוציאציה מכנית: שיטה להשגת תאים בני קיימא מרקמה

ראשית, שקלו שבר רקמה ומדדו את אורכו, רוחבו וגובהו. מניחים את הרקמה בצלחת תרבית עם מדיום תרבית וחותכים אותה לחתיכות קטנות בעזרת אזמל. מעבירים הכל לצינור C להומוגניזציה באמצעות פיפטה של פסטר.

הכניסו את הצינור לדיסוציאטור מכני והפעילו מחזורים לפי הצורך. המנגנון משתמש בכוחות מכניים כדי לחלץ תאים בודדים בני קיימא מדגימת הרקמה תוך שמירה על שלמות התאים, כולל חלבוני פני השטח. דקל את ההומוגנט באמצעות מסננת תאים המקובעת על צינור צנטריפוגה.

הומוגניזציה מחדש של הרקמה הנותרת ומתח את ההומוגנט דרך מסננת התא לתוך הצינור. צנטריפוגה את ההומוגנט ולהסיר את supernatant. כעת, השהה מחדש את כדורית התא בתווך התרבית והעבר כמות קטנה של תרחיף התא לצינור המכיל כתם כחול טריפאן.

לאחר הצביעה, להעביר את התאים על שקופית hemocytometer. ספור את התאים השקופים. התאים המתים סופגים את הכתם, מכיוון שקרום התא שלהם אינו שלם. בפרוטוקול הבא, נבצע דיסוציאציה לא אנזימטית של רקמה אנושית טרייה לניתוח כמותי ואיכותי של תאי CD45+.

- התחל בשקילת דגימת הרקמה ולאחר מכן מדידת אורך, רוחב וגובה הרקמה. לאחר מכן העבירו את שבר הרקמה לצלחת פטרי קטנה המכילה מיליליטר אחד של תווך התאים ההמטופויטיים המתאים המוגדר כימית, ללא סרום, והשתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך את הדגימות לחתיכות קטנות של 1 עד 2 מילימטר מרובע. לאחר מכן, להעביר את תוכן הכלים לתוך צינור C dissociator מכני ולשטוף את צלחת אזמל עם 2 מיליליטר של בינוני.

הוסף את השטיפה לצינור C ולאחר מכן הפעל את תוכנית הדיסוציאטור המכני 8.01 פעמיים ברציפות כדי ליצור הומוגניות עדינה של שברי הרקמה לתרחיף תא יחיד. לאחר המחזור השני, דקנט את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן השתמשו באותה פיפטת פסטר משטיפת צלחת הפטרי כדי להעביר את כל הנוזלים שנותרו בצינור C למסננת התא.

לאחר מכן, השתמש מיקרופיפטה 1 מיליליטר כדי להעביר את הנוזל המסונן לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ולשטוף את צינור C עם 3 מיליליטר נוספים של בינוני. העבירו את השטיפה דרך מסננת התא לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר מכן העבירו בעדינות את הרקמה הלא הומוגנית סביב המסננת עם קצה נקי של 1 מיליליטר כדי לסחוט את הכמות המרבית של שאריות נוזל הכלואות ברקמה לתוך צינור 50 מיליליטר. כעת הניחו את מסננת התא הפוכה על גבי צינור C המקורי ושטפו את המסננת עם 3 מיליליטר נוספים של מדיום, כך שהרקמה הלא הומוגנית תרד חזרה לתוך צינור C.

הפוך את הרקמה להומוגנית לשני מחזורים נוספים כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן שפך שוב את ההומוגנט השני דרך מסננת התא. שטפו את צינור C עם עוד 3 מיליליטר של מדיום. לאחר מכן מסננים את הסופרנאטנט דרך המסננת וסוחטים את שאריות הנוזל מתוך הרקמה, כפי שהודגם זה עתה. בשלב זה, נפח של כ 2.5 מיליליטר של השעיה תא יחיד צריך להיות נוכח בצינור 15 מיליליטר, וכ 9 מיליליטר יש לראות בצינור 50 מיליליטר.

כדי להפריד את הרקמה supernatant מן התאים, צנטריפוגה תחילה את שני צינורות הומוגנט במשך 15 דקות ב 600 Gs בטמפרטורת החדר. דקרו את הסופרנאטנט מצינור ה-15 מיליליטר לצינור של 1.5 מיליליטר, הניחו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנאטנט מצינור ה-50 מיליליטר. לאחר מכן הקש בעדינות על כל צינור על משטח קשה כדי לפרק כל אחד מכדורי התא.

השהה מחדש את גלולת התא הרופפת בצינור 50 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של מדיום והעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר כדי להשעות מחדש את הגלולה השנייה. לאחר מכן שטפו את צינור ה-50 מיליליטר עם עוד 500 מיקרוליטר בינוני והעבירו את השטיפה לצינור ה-15 מיליליטר להתאוששות מרבית של התא. לאחר ספירת מספר התאים בני קיימא על ידי הרחקת כחול טריפאן, גלולה את השעיית התא.

לבסוף, סובב למטה את הרקמה השמורה supernatant. לאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לצינור נקי אחד לפחות מבלי לגעת או להפריע לגלולה ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי במורד הזרם.