בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה: שיטה לבדיקת השפעות של תרכובות חדשות על התפשטות תאים סרטניים

כדי להתחיל, לקחת ריכוז מתאים של agarose מותך בצינור חרוטי ולהוסיף כמות רצויה של מדיום תרבית חמה אליו. הפוך בעדינות כדי לערבב את התוכן. מוסיפים את התערובת לכל באר של צלחת שש בארות, ומניחים לה להתמצק. זוהי השכבה התחתונה. לאחר מכן, לטפל בתאים סרטניים עם דריבית של עניין ולהוסיף את הריכוז הנדרש של agarose.

עכשיו, יוצקים תערובת זו המכילה את המספר הרצוי של תאים למיליליטר לתוך כל באר. זוהי שכבה המכילה תאים. לאחר שהתווך מתמצק, דוגרים על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבוע. מכינים שכבת הזנה על ידי ערבוב אגרוז למדיום ומשלימים תערובת זו עם תרכובת העניין. מוסיפים בעדינות את שכבת ההזנה לכל באר, מאפשרים לה להתמצק ודוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות.

חזור על הליך האכלה זה מדי שבוע כדי לחדש את התאים עם המדיום עד להיווצרות מושבות. אם דריבית הריבית היא מעכבת גידול, היא תדכא את צמיחת התאים וכתוצאה מכך מעט מושבות בבארות. בפרוטוקול הבא, נבצע בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לחקור את ההשפעה של מעכבי PADI על הגידול של תאי סרטן השד.

התחל הליך זה על ידי הכנת 3% 2-hydroxyethyl agarose. לתוך בקבוק זכוכית נקי ויבש 100 מיליליטר, להוסיף 0.9 גרם של 2-hydroxyethyl agarose ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים. חממו את התערובת במיקרוגל למשך 15 שניות וערבלו בעדינות. חזור על שלב זה עד שאבקת האגרוז מתמוססת לחלוטין. לאחר מכן, autoclave את הפתרון המכיל בקבוק במשך 15 דקות.

הניחו לתמיסת האגרוז להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שימוש נוסף. מחממים מראש כמה פיפטות של חמישה מיליליטר ו -10 מיליליטר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגרוז להתמצק בפיפטה בעת הטיפול. שחררו חלקית את מכסה הבקבוק וחממו במיקרוגל את תמיסת האגרוז 2-הידרוקסיאתיל 2-הידרוקסיאתיל מוכנה מראש למשך 15 שניות. לאחר מכן מערבלים בעדינות את התמיסה ומחממים במיקרוגל למשך 15 שניות נוספות.

היזהר בעת ערבול תמיסת האגרוז מכיוון שהתמיסה עולה כאשר היא נחשפת לאוויר ויכולה להישפך. אם יש שאריות ג'ל מוצק בבקבוק, חממו במיקרוגל עוד כמה שניות. שמור את הבקבוק המכיל את תמיסת האגרוז באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס במהלך השלבים הבאים כדי למנוע מתמיסת האגרוז להתמצק בטרם עת.

לאחר מכן, להעביר 12 מיליליטר של מדיה מחוממת באמצעות פיפטות שחוממו מראש לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. מיד להוסיף שלושה מיליליטר של תמיסת agarose 3% בעדינות להפוך את הצינור החרוטי כדי לערבב את agarose עם התקשורת. לאחר מכן הוסיפו בעדינות שני מיליליטרים של תערובת זו לכל באר של צלחת תרבית בת שש בארות מבלי ליצור בועות אוויר. דוגרים אופקית על צלחת התרבית בת שש הבארות על משטח שטוח בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר לתערובת להתמצק.

לאחר שהתערובת מתמצקת, מכניסים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.

היבט קשה של הליך זה הוא לוודא כי כל התאים מופצים באופן שווה וכי ג'ל agarose מומס לא להתמצק לפני תוספת לכל באר, כדי להבטיח כי התאים מעורבבים בתקשורת לפני הוספת ג'ל agarose נוזלי. בנוסף, פיפטות מחוממות מראש כדי למנוע מהתמיסות להתמצק בזמן הטיפול.

כדי להכין את התא המכיל שכבה, תחילה טריפסין MCF10DCIS התאים ולדלל אותם לריכוז תאים של 40,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן לקחת שמונה מיליליטר של מדיה באמצעות פיפטות שחוממו מראש, ולהעביר לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. מיד להוסיף שני מיליליטר של 3% agarose לצינור חרוט, בעדינות להפוך כדי לערבב את agarose עם התקשורת. הימנעו מיצירת בועות.

לאחר מכן, קח שני מיליליטר של התאים וטפל בהם עם שני BB-כלור-amidine מיקרומולרי ב- DMSO, או DMSO בלבד כבקרה. לאחר הטיפול, מערבבים את התאים עם אגרוז 0.6% בדילול אחד לאחד כדי ליצור ריכוז סופי של BB-כלור-אמידין מיקרומולרי אחד. לאחר מכן לקחת מיליליטר אחד של תערובת התא agarose ולהוסיף בעדינות על השכבה התחתונה של צלחת תרבית שש בארות.

הניחו את צלחת התרבית בעלת שש הבארות אופקית על משטח שטוח בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לשכבה העליונה להתמצק. לאחר שהתערובת מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפני הוספת שכבת ההזנה. התחילו בהכנת שכבת ההזנה על ידי גלישה במיקרו של תמיסת האגרוז 2-הידרוקסיאתיל 2-הידרוקסיאתיל מוכנה מראש כמו קודם, ושיווי משקל בקבוק תמיסת האגרוז באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס.

מערבבים מיליליטר אחד של תמיסת אגרוז 3% עם תשעה מיליליטר של מדיה חמה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, והופכים בעדינות כדי לערבב את האגרוז עם התקשורת. הימנעו מיצירת בועות אוויר. לאחר הטיפול בתערובת עם BB-כלור-אמידין, מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד מהתערובת לכל באר של צלחת התרבית בעלת שש הבארות המכילה את השכבות התחתונות והרכות. לאחר מכן הניחו את צלחת התרבית בעלת שש הבארות אופקית על משטח שטוח בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לתערובת להתמצק.

לאחר ששכבת ההזנה מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. חזור על הליך הזנה זה מדי שבוע על ידי כיסוי מיליליטר אחד של 0.3% תמיסת טיפול בינונית אגרוז על שכבת ההזנה הקיימת כדי לחדש את התאים במדיה חדשה עד להיווצרות המושבה.