הכנת דגימות למטבולומיקה: שיטה להכנת דגימות תאים לפרופיל מטבוליטים

מטבולומיקה היא המחקר לזיהוי וכימות מטבוליטים הנמצאים בתוך התאים. כדי להכין את הדגימה, התחל על ידי זריעת תאי סרטן השד יחד עם מדיום הצמיחה בשתי צלחות המסומנות כבדיקה ובקרה. דוגרים במשך שלושה ימים בחום של 37 מעלות צלזיוס. כעת, הסר את המדיום והוסף מדיום טרי עם אסטרדיול בצלחת הבדיקה ומדיום רגיל בצלחת הבקרה.

האסטרדיול נקשר לקולטן אסטרוגן אלפא בתאי סרטן השד כדי לגרום לביטויים מסוימים, מה שגורם לשינוי בהרכב המטבוליטים. דוגרים על הצלחות למשך הזמן הרצוי. החלף את המדיום במי מלח חוצצים פוספט קר כקרח או PBS כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן להוסיף אצטון קר כקרח. ריאגנטים קרים כקרח לעצור את הפעולה של פרוטאזות ובכך למנוע פירוק חלבון.

עכשיו להשתמש מגרד לנתק את התאים מן הצלחות, ולהעביר אותם צינורות בעזרת פיפטה. קח 20 מיקרוליטר של תרחיף התא הזה על hemocytometer ולספור את מספר התאים. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שישמשו אותן לניתוח נוסף. בפרוטוקול הבא אנו מכינים דגימות מתאי MCF-7 עבור כרומטוגרפיית גז וספקטרומטריית מסות.

באמצעות תאי MCF-7 שגודלו בתרבית על פי פרוטוקול הטקסט, הוסיפו חמישה מיליליטר של PBS 1x קר כקרח לצלחת. לאחר מכן הטה את הצלחת מספר פעמים לפני הסרת PBS. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות, הסירו כמה שיותר PBS לאחר השטיפה האחרונה. הוסיפו 750 מיקרוליטר של אצטון מצונן לכל צלחת וגרדו את התאים, ואז שלבו את התאים משתי צלחות לצינור של שני מיליליטר על קרח.

כדי לספור את התאים לנורמליזציה, עבור כל טיפול, השתמש בשני לוחות נוספים לכימות התא. ואז כדי לנתק את התאים מן הצלחות להוסיף 2 מיליליטר של חיץ HE לדגור במשך חמש דקות. מערבבים היטב את התאים על ידי פיפטציה במאגר HE.

לאחר מכן השתמש 20 מיקרוליטר של תמיסת התא בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התא תחת מיקרוסקופ. אחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש בניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז כדי לזהות ולכמת את המטבוליטים. ביצוע ניתוח אינטגרטיבי בהתאם לפרוטוקול הטקסט.