רפידות שומן חלב דה-צלולריות: הפקת הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית מפדים לשומן חלב

ראשית, הניחו רפידות שומן חלב או MFPs בצלחת עם תמיסת טריפסין-EDTA ודגרו למשך הזמן הרצוי כדי לשבור את הידבקויות מטריצת התא. שטפו את המדפסות הרב-תכליתיות במים נטולי יונים, וסננו אותן דרך מסננת. מניחים רקמות בכוס עם מוט ערבוב ומוסיפים Triton X-100. יש לערבב לתאי ליזה מבלי להשפיע על גורמי הגדילה במטריצה החוץ תאית של הרקמה.

מסננים את המדפסות הרב-תכליתיות ושוטפים במים נטולי יונים. מעבירים רקמות בחזרה לכד, ומוסיפים חומצה דאוקסיקולית כדי לליז את התאים הנותרים. לאחר מכן, סננו את המדפסות הרב-תכליתיות והניחו בכד המכיל מים שעברו דה-יוניזציה עם פניצילין-סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. דוגרים על הכד ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

מסננים את המדפסות הרב-תכליתיות ומניחים אותן בתוך המכילה אתנול וחומצה פראצטית. החומצה הפראצטית מגבירה את הנוקשות של המטריצה החוץ תאית של הרקמה. מערבבים זמן מה וחוזרים על שלב המאמץ. שטפו את המדפסות הרב-תכליתיות עם PBS ולאחר מכן עם מים שעברו דה-יוניזציה. העבירו את המדפסות הרב-תכליתיות המתוחות לכוס המכילה פרופאן-1-ol.

מערבבים במשך זמן מה, מסננים את התוכן ושוטפים מדפסות משולבות במים נטולי יונים. יבשו את המדפסות הרב-תכליתיות ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול הבא, נבצע decellularization של כריות שומן חלב murine.

ראשית, הניחו את המדפסות המשולבות בצלחות של שישה סנטימטרים עם חמישה מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA. רססו ונגבו את הכלים באתנול 70% ודגרו בחום של 37 מעלות למשך שעה. השתמשו במסננות בקוטר 0.7 מ"מ כדי לשטוף את המדפסות הרב-תכליתיות במים נטולי יונים, על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמשו במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות.

לאחר מכן, יבש בקצרה את הרקמה על משימה עדינה לנגב ולשקול אותו. הניחו את הרקמות המיובשות בכד טרום אוטוקלאבי המכיל מוט ערבוב בגודל מתאים, וכסו את הרקמות ב-60 מיליליטר של 3% T-אוקטילפנוקסי פוליאתוקסיאתנול לגרם רקמה. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את תכולת הכוסות למסננת.

שטפו את הכד במים נטולי יונים, ושפכו אותם על הרקמות. חזרו על תהליך השטיפה פעמיים נוספות, והקפידו להשתמש במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על משימה עדינה לנגב ולשקול. מחזירים את הרקמות ואת מוטות הערבוב לאותן כוסות ומכסים אותן ב-60 מיליליטר של 4% חומצה דאוקסיקולית לגרם רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה.

לאחר מכן, שפכו את תכולת הכד למסננת רשת. שטפו את הכד במים נטולי יונים, ושפכו אותם על הרקמות. חזרו על תהליך השטיפה פעמיים נוספות, והקפידו להשתמש במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות. יבשו בקצרה את הרקמה השטופה במשימה, נגבו ושקלו אותה.

הכניסו את הרקמות המיובשות לאותו יחד עם מים טריים שעברו דה-יוניזציה בתוספת סטרפטומיצין 1% פניצילין. מכסים היטב את הכד בסרט פרפין ומשאירים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, סננו את תכולת הכד למסננת. יבשו בקצרה את הרקמה במשימה עדינה, נגבו ושקלו אותה. לאחר מכן, הניחו את המדפסות המשולבות באותו עם מוט ערבוב בגודל מתאים.

לכסות את הרקמה עם 60 מיליליטר של פתרון המכיל 4% אתנול ו 0.1% חומצה peracetic לכל גרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. שפכו את תכולת הכד למסננת בקוטר 0.7 מילימטר. השתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני ולהחזיר את התוכן לתוך הכד. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 מיליליטר של 1X PBS לכל גרם של רקמה.

מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזרו על כל תהליך הכביסה פעם נוספת. לאחר מכן, השליכו את תכולת הכד למסננת 0.7 מילימטר. בעזרת מלקחיים, עסו ידנית את הרקמה והחזירו את תכולתה לכד. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 מיליליטר של מים deionized לכל גרם של רקמה.

מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזרו על כל תהליך הכביסה פעם נוספת. יבשו בקצרה את הרקמה שטופה במשימה עדינה, נגבו ושקלו אותה. יש לזרוק את הרקמה ותכולתה למסננת ולהשתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. החזירו את התוכן לכד וכסו את הרקמות ב-60 מיליליטר של 100% n-פרופנול לגרם רקמה.

מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, יבש בקצרה את הרקמה על משימה עדינה לנגב ולשקול אותו. יש לזרוק את הרקמה והתכולה למסננת בקוטר 0.7 מ"מ ולהשתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. החזירו את התוכן לכד ושטפו את הרקמה על ידי כיסויו ב-60 מיליליטר מים שעברו דה-יוניזציה לכל גרם רקמה.

מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזרו על תהליך השטיפה שלוש פעמים. לאחר מכן, יבש בקצרה את הרקמה על משימה עדינה לנגב ולשקול אותו. מעבירים את הרקמה לצינור מסומן של 15 מיליליטר ומקפיאים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.