JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:55 דק' • April 30th, 2023
- ראשית, הניחו עכבר שעבר המתת חסד על לוח נתיחה. ממש מעל הבטן, לחתוך דרך העור ואת הצפק. מנקבים את הסרעפת וחותכים לאורך הצלעות וכלוב הצלעות עד קנה הנשימה. צור חתך קטן בקנה הנשימה. הכנס בעדינות מחט לתוך קנה הנשימה מבלי לפגוע בקרינה וחבר אותה במלקחיים. יש להזריק לאגרוז נקודת התכה נמוכה בטמפרטורת גוף רגילה בתוך הריאות. לאט להסיר את המזרק ולשמור את המחט בפנים כדי למנוע את הזרימה האחורית של agarose.
שפכו PBS קר על הריאות כדי לקדם ג'לינג אגרוז. הסר את המחט וחבר את קנה הנשימה במלקחיים כדי למנוע זרימה חוזרת של אגרוז לא מוצק. לפתוח את עצם החזה, להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים, לחתוך אותו באמצעות מספריים. משוך את הריאות מחלל החזה. להפריד את האונות בתקשורת. יש להניח בתוך בארות הדמיה בתנאים פיזיולוגיים למיקרוסקופיה. אגרוז משמר את מורפולוגיית הריאות בטמפרטורות פיזיולוגיות המסייעות לצפות באינטראקציות תאיות חיות. בפרוטוקול הבא, נדגים הדמיה חיה ex vivo של ריאות כדי לחקור אינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי סטרומה.
- כדי להכין את הריאות להדמיה חיה ex vivo, התחל על ידי השתקת העכבר על מכסה קצף פוליסטירן מכוסה חתיכת השריה ולעקר את החיה עם 70% אתנול. לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך אפיגסטרי רוחבי דרך העור, ואחריו חתך דומה דרך הצפק. לאחר מכן, הזזת לוח הדיסקציה למצב אנכי, חתכו את אבי העורקים היורד כך שהדם ייכנס לבטן ולא לחלל החזה.
חותכים פתח קטן בסרעפת כדי לשחרר את הוואקום, ואז חותכים לאורך כלוב הצלעות כדי להסיר את הסרעפת ולדמיין את הריאות. באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את העור עד קנה הנשימה מעל כלוב הצלעות, משאיר את הצלעות שלם. לאחר מכן להפריד את העור מכלוב הצלעות ולהסיר את רקמת החיבור שמסביב כדי לחשוף את קנה הנשימה, תוך הקפדה לא לפגוע בקנה הנשימה עצמו. חותכים פתח קטן בקוטר של כ-1 מילימטר בקנה הנשימה החשוף במקביל לטבעות הסחוס קרוב ככל האפשר לגרון, מבלי לחתוך לחלוטין דרך קנה הנשימה.
לאחר מכן הכנס בעדינות מחט 20 מד 4 עד 5 מ"מ לתוך קנה הנשימה ללא כל כוח נגדי. קצה המחט צריך להיות גלוי דרך קנה הנשימה. ממלאים מזרק עם 400 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס 2% טמפרטורת התכה נמוכה agarose, ולאחר מכן לייצב את המחט עם מלקחיים. שמירה על לוח הדיסקציה אנכי, להחדיר לאט את כל כמות האגרוז החם דרך המחט לתוך הריאות. לאחר ניפוח הריאות, נתקו את המזרק תוך שמירה על המחט בתוך קנה הנשימה ושפכו כ-50 מיליליטר של 20 מעלות צלזיוס PBS על הריאות כדי לסייע בקיבוע האגרוז.
כאשר האגרוז התמצק, הסר את המחט והשתמש במלקחיים כדי לסגור את קנה הנשימה כדי למנוע דליפה של כל אגרוז לא מוצק. כעת, פתחו את החזה עוד יותר על ידי עצם החזה ואחזו בקנה הנשימה במלקחיים. לאחר מכן, באמצעות זוג מספריים כירורגיים, לחתוך דרך קנה הנשימה לחלוטין. כדי להסיר את הריאות, למשוך בעדינות את קנה הנשימה למעלה, לחתוך את רקמת החיבור ואת הוושט, ולמשוך את הריאות לחלוטין מתוך חלל החזה.
לטבול את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס RPMI 1640 כדי לשטוף את הדם עודף. בעזרת מספריים ומלקחיים, חותכים את סימפונות הגבעול הראשי של האונות בהילום ומפרידים בעדינות את אונות הריאה. מעבירים את האונות לבאר אחת של משטח שטוח של צלחת הדמיה של 24 בארות כלפי מטה ומכסים את הרקמה ב-100 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס סל"ד 1640. הניחו כמה מגלשות כיסוי מיקרוסקופ עגולות של 15 מיליליטר על גבי האונות כדי למנוע מהן לצוף, ושפכו PBS חם לבארות שמסביב כדי למנוע מהתווך להתאדות. לאחר מכן הכניסו את צלחת 24 הקידוחים לתא האקלים, והעבירו את החדר לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי.