תרבית משותפת תלת ממדית של תאי סרטן ריאות עם CAFs: מערכת מודל חוץ גופית לחקר התקדמות הגידול

- בתרביות משותפות תלת-ממדיות, סוגי תאים מרובים גדלים יחד במטריצות כמו מטריצת קרום מרתף, המחקה את המיקרו-סביבה הטבעית של מטריצה חוץ-תאית, ומאפשרת אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים. כדי לבסס תרבית משותפת תלת-ממדית משובצת, הכינו תרחיף אחיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן או CAFs ותאי סרטן ריאה שנלקחו לשניים הוא ליחס אחד, במטריצת קרום המרתף. שמרו על המתלים על קרח כדי למנוע התמצקות מטריצה בטמפרטורות הסביבה.

מעבירים נפח מתאים של תרחיף לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הדרוש להטמעה משותפת של התאים במטריצה. כדי לבסס תרבית משותפת תלת-ממדית, הכינו תרחיף של תאי סרטן הריאה במטריצת קרום מרתף, בצפיפות התא הרצויה. שמור על המתלה על קרח. פיפטה נפח מתאים של תרחיף מטריצת תאים זה לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להקים את מונוקולטורה התאים הסרטניים המשובצים.

לאחר מכן להעביר את הנפח הרצוי של CAFs התלויים במדיה תרבית מועדפת, על פני התאים הסרטניים המשובצים. בתרביות משותפות תלת-ממדיות, CAFs מגבירים את היווצרות התאים הסרטניים ומושכים תאים סרטניים, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים דמויי דמעות. בפרוטוקול זה, נבצע תרבית משותפת של תאי סרטן הריאה TUM622 ו-CAFs כדי לחקור את האינטראקציה ביניהם.

- לאחר הכנת תרחיפים של תאים של TUM622 ו-CAFs, כפי שתואר קודם לכן, יש לספור את צפיפות תאי CAF על ידי ערבוב של 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול. הוסף 10 מיקרוליטר של התערובת לכל אחד משני התאים על hemocytometer כדי לספור ולחשב צפיפות התא. כדי להטביע במשותף תאי TUM622 ותאי CAF במטריצת קרום מרתף, חשב תחילה את מספר התאים הרצוי המשמש לציפוי, בהתבסס על מידע צפיפות התא. CAFs נזרעים ביחס של 2 ל-1 של תאי TUM622. העבירו את הנפח המחושב של TUM622, כמו גם את השעיית תאי CAF, לאותו צינור צנטריפוגה. לסובב למטה ולשאוף את כל המדיום. מרחפים מחדש במטריצת קרום מרתף וצלחת 310 מיקרוליטר של התערובת לתוך כל באר של צלחת 24 באר. עבור immunofluorescence, להעביר 60 מיקרוליטר של תערובות TUM622 ו- CAF לשקופיות תא כפי שתואר קודם לכן.

כדי ליצור תרבות משותפת TUM622 עם CAF שכבת-על במטריצת קרום מרתף, הגדירו תחילה מונוקולטורה TUM622 כפי שתואר קודם לכן. מעבירים מספר כפול של מתלי CAF לצינור צנטריפוגה ומסתובבים מטה במהירות של 300 כפול 'גרם' במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-CAFs במיליליטר אחד של מדיום תרבית תלת-ממדית. העבירו את מתלה CAF של מיליליטר אחד לבאר המכילה את תאי TUM622 המוטבעים.