JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:38 דק' • April 30th, 2023
- בתור התחלה, זרעו את תאי סרטן הריאה בבקבוק T המכיל תרבית רקמה ותנו לו לגדול בן לילה. לאחר מכן, להשעות miRNA עם סוכן transfecting לתוך מדיום transfecting. הסר מדיה והוסף מדיום מדביק שיכניס miRNA לתאים סרטניים. miRNA היא מולקולת RNA לא מקודדת שנקשרת לרצף mRNA משלים וחוסמת ביטוי גנים. לדגור על הבקבוק למשך הזמן הרצוי.
לאחר מכן, להחליף את המדיה עם מדיה תרבית רקמות ולגדול בן לילה. הוסף טריפסין לדיסוציאציה של תאים. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה המכיל PBS וצנטריפוגה אותה. הסר את supernatant ולהוסיף חיץ lysis לתאי lyse ולהוסיף אתנול טהור במיוחד עבור משקעים. מניחים את התערובת בעמוד הפרדה לטיהור חומצת גרעין וצנטריפוגה.
הסר את הזרימה והוסף חיץ שטיפה כדי להסיר את קרום התא הליזד והצנטריפוגה. הסר את מאגר השטיפה והוסף DNase עם מאגר עיכול DNase כדי להסיר DNA מהדגימה והצנטריפוגה. הוסף חיץ הכנת RNA כדי לבודד RNA וצנטריפוגה. אספו את הרנ"א שנמצא בסופרנטנט. בפרוטוקול הבא נבצע מיצוי RNA מתאי סרטן ריאה שטופלו ב-miRNA.
- ראשית, זרעו את התאים הסרטניים בבקבוק מתאים המספיק למיצוי RNA וחלבונים לביצוע ביטוי גנים באמצעות qPCR או ניתוח microarray . לאחר מכן יש לדגור למשך הלילה עם תוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
למחרת מכינים את דגימת המיקרו-רנ"א לטרנספקציה על ידי דילול מיקרו-רנ"א 143 ומיקרו-רנ"א 506 במדיה, בריכוז של 100 ננו-מולארי כל אחד. מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור, ומוציאים את התקשורת. יש לשטוף עם 1 x PBS.
כל הפקדים שלא טופלו יכילו רק מדיה חלקית עם תאים. לדגור על התאים עם אמצעי טרנספקציה במשך שש שעות באינקובטור. לאחר שש שעות, להסיר את המדיה ולהחליף עם 4 מיליליטר של מדיה מלאה טרייה. קצור את התאים לאחר 24 שעות ו 48 שעות על ידי טריפסיניזציה.
לאחר מכן שטפו פעמיים עם 1x PBS בכל צינור, והסירו סופרנטנט. על מנת לבצע מיצוי RNA במועד מאוחר יותר, להקפיא את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.
- מיצוי ה-RNA בוצע באמצעות ערכת RNA, בהתאם להוראות היצרן. ראשית להסיר את הצינורות מ מינוס 80 מעלות צלזיוס ולאפשר להפשיר.
- הוסיפו 300 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את קרום התא. הוסף נפח שווה של אתנול 100% טהור במיוחד. לאחר מכן מערבבים היטב ומניחים בטור המפריד. צנטריפוגה ולהסיר את הזרימה דרך.
הוסף 400 מיקרוליטר של חיץ כביסה וצנטריפוגה כדי להסיר את החיץ. הוסף 5 מיקרוליטר של DNAse I עם 75 מיקרוליטר של חיץ עיכול DNA בכל דגימה ודגור במשך 15 דקות. לאחר מכן לשטוף את הדגימה עם 400 מיקרוליטר RNA הכנה חיץ הכנה.
לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם מאגר שטיפת RNA. כעת הוסיפו מים נטולי נוקלאז לעמודה, לצנטריפוגה ואז אספו את הרנ"א. למדוד את ריכוז RNA, בשלב זה, 2 מיקרוגרם של דגימת RNA ניתן לשלוח עבור ריצוף RNA.