ניתוח מחזור התא: גישה לחקר ויסות מחזור התא של תאי סרטן ריאה נגועים ב- miRNA
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:34 דק׳ • April 30th, 2023
- מיקרו-רנ"א או miRNA הוא רנ"א קטן שאינו מקודד. לאחר טרנספקציה של mRNA או החדרתו לתא, הוא יוצר קומפלקס חלבון miRNA. הקומפלקס מכוון ונקשר ל-mRNA ספציפי ומווסת באופן שלילי את ביטויו, ועוצר את התקדמות מחזור התא.
כדי להתחיל את הניתוח, הוסף קיבוע מייבש מתאים לתרבית שנקטפה של תאי סרטן ריאות נגועים miRNA. הקיבוע משמר את התאים וגם מחלחל את קרום התא. טפלו בתאים בתערובת של פרופידיום יודי, צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין ואנזים ריבונוקלאז.
הצבע נכנס לתאים ומכתים גם את הדנ"א וגם את הרנ"א. האנזימים מפרקים באופן ספציפי את הרנ"א ומאפשרים כימות DNA אופטימלי. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את שיעור התאים שנעצרו בשלבים שונים של מחזור התא בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של תאים בודדים.
התאים בשלבי מנוחה וגדילה הם בעלי תכולת דנ"א נמוכה יותר ולכן עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר. התאים בשלב גאפ 2 עם כמות כפולה של דנ"א מייצרים עוצמת פלואורסצנטיות כפולה. התאים בשלב סינתזת הדנ"א גורמים לערך פלואורסצנטי בין שתי האוכלוסיות האחרות. הפרוטוקול הבא ינתח את ויסות מחזור התא של תאי סרטן ריאות שטופלו ב-miRNA על ידי מדידת תכולת הדנ"א שלהם באמצעות צביעת PI וציטומטריית זרימה.
- הדבק את התאים כמתואר בחלק הקודם של סרטון זה. קצור תאים מכל דגימה בצינורות סטריליים נפרדים של 15 מיליליטר על ידי טריפסיניזציה. לאחר מכן, לשטוף את ה
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים