JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:34 דק' • April 30th, 2023
- מיקרו-רנ"א או miRNA הוא רנ"א קטן שאינו מקודד. לאחר טרנספקציה של mRNA או החדרתו לתא, הוא יוצר קומפלקס חלבון miRNA. הקומפלקס מכוון ונקשר ל-mRNA ספציפי ומווסת באופן שלילי את ביטויו, ועוצר את התקדמות מחזור התא.
כדי להתחיל את הניתוח, הוסף קיבוע מייבש מתאים לתרבית שנקטפה של תאי סרטן ריאות נגועים miRNA. הקיבוע משמר את התאים וגם מחלחל את קרום התא. טפלו בתאים בתערובת של פרופידיום יודי, צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין ואנזים ריבונוקלאז.
הצבע נכנס לתאים ומכתים גם את הדנ"א וגם את הרנ"א. האנזימים מפרקים באופן ספציפי את הרנ"א ומאפשרים כימות DNA אופטימלי. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את שיעור התאים שנעצרו בשלבים שונים של מחזור התא בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של תאים בודדים.
התאים בשלבי מנוחה וגדילה הם בעלי תכולת דנ"א נמוכה יותר ולכן עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר. התאים בשלב גאפ 2 עם כמות כפולה של דנ"א מייצרים עוצמת פלואורסצנטיות כפולה. התאים בשלב סינתזת הדנ"א גורמים לערך פלואורסצנטי בין שתי האוכלוסיות האחרות. הפרוטוקול הבא ינתח את ויסות מחזור התא של תאי סרטן ריאות שטופלו ב-miRNA על ידי מדידת תכולת הדנ"א שלהם באמצעות צביעת PI וציטומטריית זרימה.
- הדבק את התאים כמתואר בחלק הקודם של סרטון זה. קצור תאים מכל דגימה בצינורות סטריליים נפרדים של 15 מיליליטר על ידי טריפסיניזציה. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS על ידי צנטריפוגה ב 751 גרם במשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את supernatant. השהה ושבור את הגלולה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר קר כקרח 1X PBS באמצעות פיפטינג.
הוסף 2 מיליליטר של אתנול קר כקרח 70% טיפה לצינור תוך ערבול הצינור בעדינות כדי לתקן את התאים. לדגור צינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ומניחים אותם 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. הסר את הצינורות מ 4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה.
הוסף 2 מ"ל PBS קר כקרח ומערבולת ולאחר מכן להסיר את supernatant על ידי צנטריפוגה. יש להוסיף 500 מיקרוליטר של 1X PBS המכיל פרופידיום יודיד וריבונוקלאז A בריכוזים 50 ו-200 מיקרוגרם למיליליטר, בהתאמה, בכל דגימה ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו דגימות לצינורות מתאימים המגנים מפני אור ופעלו על ציטומטר זרימה.
מחקר זה בוחן את תפקידם של microRNA (miRNA) בבקרת מחזור התא של תאי סרטן ריאה. באמצעות שימוש בציטומטריית זרימה ובצביעה ב-propidium iodide, המחקר שואף לכמת את תכולת ה-DNA ולנתח את שלבי מחזור התא בתאים שעובדו ב-miRNA.
ניתוח כמותי של מחזור התא בתאי סרטן ריאה שעברו טרנספקציה של miRNA מאפשר בחינה מדויקת של מנגנוני בקרה של מחזור התא הרלוונטיים לגילוי תרופות אונקולוגיות. מדידת תכולת DNA מבוססת ציטומטריית זרימה מספקת נתונים יישומיים לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מנגנוניים בתוכניות טיפוליות בשלבים מוקדמים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בנקודות מפנה מרכזיות בשרשרת המחקר והפיתוח (R&D) האונקולוגית.
ניתוח מחזור התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה זה משתלב ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, ותומך הן בתיקוף מטרות והן בזיהוי מובילים (leads) במחקר אונקולוגי.
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026