מדוע בדיקת השערת האפס חשובה עבור ציטומטריית זרימה של PD-L1?

בדיקת השערת האפס בציטומטריה של זרימה עבור PD-L1 מאפשרת הערכה אובייקטיבית של השאלה האם ביטוי הסמן שנצפה שונה באופן מובהק בין קבוצות הניסוי, ובכך היא תומכת בתיקוף יעדים קפדני ומצמצמת תוצאות חיוביות שגויות בשלבי הגילוי המוקדמים.

כיצד בידוד משתנה בלתי תלוי משתלב בזרימות עבודה של תרחיף תאי ריאה?

בידוד משתנים כגון ריכוז האנזים וזמן הדגרה מבטיח כי שינויים בתשואת התאים או בביטוי הסמן ייכתבו לתנאי הניסוי, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת לפרש את התוצאות במסלולי גילוי.

מה מאפשרות מדידות של ציטומטריית זרימה כמותית במודלים של ריאה?

ציטומטריה של זרימה כמותית מספקת נתונים מדויקים על אוכלוסיות תאים וביטוי של סמנים, מה שמאפשר ניתוח השוואתי בין תנאים שונים ותומך בקבלת החלטות מבוססת נתונים במחקרים של אימونو-אנקולוגיה.

מדוע דרישות השכפול קריטיות עבור פרוטוקולים של הכנת תאי ריאה?

שכפול מבטיח שתוצאות בידוד התאים וציטומטריית הזרימה יהיו עקביות בין ניסויים וצוותים, ובכך מקל על שיתוף פעולה בין-תפקודי וקידום מהימן של תוכניות פרה-קליניות.

אילו יכולות ניתוח סטטיסטי נדרשות לפני ביצוע מחקרי PD-L1 בשיטת ציטומטריה זרימה?

נדרש ניתוח סטטיסטי חסון כדי לפרש נתוני ציטומטריה של זרימה, להעריך את המובהקות של הבדלים בביטוי סמנים, ולהנחות החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בתהליכי עבודה של תיקוף מטרות.

הכנת ריאות עכבר לציטומטריית זרימה: יצירת תרחיף תאים מרקמת הריאה לאנליזה ציטומטרית של זרימה

JoVE Encyclopedia of Experiments

מחקר סרטן

0 צפיות • 3:48 דק' • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- התחילו בלקיחת עכבר שעבר המתת חסד ואבטחו אותו על לוח דיסקציה בעזרת סרט מעבדה. השתמש מספריים כדי לחתוך את העור. בצע חתך אנכי דרך הסרעפת וחתך צלעות כדי להגיע לחלל החזה החושף את הלב והריאות. לאחר מכן, לבצע חתך קטן בחדר השמאלי של הלב. לאחר מכן, אתר את החדר הימני והכנס מזרק המכיל PBS לתוך לומן החדר. יש לערבב PBS דרך החדר הימני ולאפשר לדם לזרום החוצה מהחתך המוכן מראש בחדר השמאלי עד שהריאות הופכות ללבנות. מוציאים את רקמת הריאה המכילה גושים סרטניים וטוחנים לחתיכות קטנות.

לדגור את החתיכות במאגר עיכול הריאות. Collagenase במאגר העיכול של הריאות עוזר לבודד תאים, ו- DNAse עוזר לסלק DNA מהתאים המתים. מסננים את המתלה שנוצר דרך מסננת תאים כדי להסיר גושים ולהפוך את תרחיף התא לאחיד. צנטריפוגה ולהשהות מחדש את הגלולה במאגר אשלגן אמוניום כלורי כדי ליז אריתרוציטים שיורית. צנטריפוגה לאיסוף WBCs ותאי הגידול בכדורית. השהה מחדש את הגלולה ב- PBS בתוספת FCS, כדי לשמור על יציבות התא. בפרוטוקול הבא נדגים את הכנת תרחיף תאי הריאה לאנליזה ציטומטרית של זרימה.

לאחר נקודת הסיום הניסויית המתאימה, השרו את הפגר באתנול 70% ואבטחו את בעל החיים ללוח נתיחה. בצעו חתך בקו האמצע הגחוני והפכו בעדינות את העור כדי לחשוף את שרירי דופן בית החזה ואיברי הבטן. השתמש מספריים כדי לנקב את הסרעפת לחתוך את הצלעות לחשוף את חלל החזה. חתכו פתח קטן בחדר השמאלי והשתמשו במחט במד 27 כדי לחורר את הריאה שלוש פעמים דרך החדר הימני עם 6 עד 8 מיליליטר PBS קר כקרח לכל עירוי. לאחר הזילוח האחרון הריאות צריכות להיות נקיות לחלוטין מדם ולהיראות לבנות. לאחר הקציר, השתמש מספריים כדי לטחון את רקמת הריאה לחתיכות קטנות.

מעבירים את שברי הריאה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של חיץ עיכול ריאות למשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. בסוף העיכול, העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר, והשתמשו בקצה של בוכנה סטרילית של מזרק 10 מיליליטר כדי ללחוץ על כל שברי הרקמה שנותרו דרך המסנן. שטפו את המסננת עם 15 מיליליטר של PBS בתוספת 2% FCS, ואספו את התאים בצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ אשלגן ליזה אמוניום כלורי למשך 5 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה את התאים שוב. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת תאי הדם הלבנים במיליליטר אחד של PBS בתוספת 2% FCS, ולהכתים את התאים לניתוח ציטומטרי זרימה על פי פרוטוקול הניסוי.