Zebrafish Xenograft Assay: שיטה להערכת היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים על גידולים בדגי זברה in vivo

- ראשית, מניחים את הביצים בצלחת פטרי, ומוסיפים את התמיסה של דניאו כדי לשמור על ביצים טריות שנאספו. מוסיפים פניל תיוראה כדי לעכב פיגמנטציה ולדגור במשך כמה ימים. לאחר הדגירה, dechorionate את העוברים באמצעות מלקחיים חדים ולתת להם לגדול עוד יותר.

לאחר מכן, זרעו את המספר הרצוי של תאים סרטניים בבקבוק תרבית ודגרו בן לילה. עכשיו להוסיף תרכובות אנטי סרטניות לדגור עוד. לאחר הדגירה מוסיפים צבע פלואורסצנטי למעקב אחר תאים, אשר ייקשר לקרום התא ויכתים את התאים.

לאחר מכן, הוסף טריפסין לדיסוציאציה של תאים ודלל את התאים בתמיסת PBS האדומה פנול לפני ההליך להערכת pH. הר עוברי דגי זברה מורדמים על צלחת אגר. עכשיו לטעון את microcapillary עם השעיה תאים סרטניים להזריק אותו לתוך שק החלמון של עוברים.

להחזיר עוברים לצלחות תרבית המכילות את התמיסה של דניאו ולדגור הלאה. לאחר מכן, להעביר כמה עוברים על שקופית זכוכית ולהוסיף methylcellulose כדי לשתק אותם. הניחו את המגלשה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמתו את גודל הגידול באמצעות התוכנה.

תרכובות אנטי-סרטניות בדרך כלל מעכבות את יכולת יצירת הגידול של תאים סרטניים. בפרוטוקול הבא נחקור את ההשפעה של הידרוקסיקומרין, יחד עם BH3 מימטי, על היווצרות גידולים בדגי זברה in vivo.

- לאחר זריעת תאי A549 ודגירתם בתרכובות על פי פרוטוקול הטקסט, 24 שעות לפני סיום הטיפול, יש להוסיף ארבעה מיקרומולרים של צבע עוקב התאים הפלואורסצנטי CM-Dil כדי להכתים את התאים ולדגור עליהם למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, השתמש 0.05% טריפסין EDTA כדי טריפסינזציה של התאים. לאחר מכן יש לדלל 10 לתאים ה-6 ב-50 מיקרוליטר של תמיסת PBS אדומה פנול לפני ההזרקה. כדי לבצע מיקרו-הזרקה של תאים סרטניים, משוך נימי זכוכית 1.0 מילימטר באמצעות הגדרות התוכנית הבאות.

השתמש מזרק לחתוך את הנימים כדי לייצר קצה חד. לאחר מכן לטעון את microcapillary עם 20 מיקרוליטר של התא פנול תמיסת אדום. לאחר הרדמת דגי זברה על פי פרוטוקול הטקסט, יש להזריק 100 עד 200 תאים לתוך שק החלמון על ידי הזרקת 6 עד 10 ננוליטר באמצעות שלוש עד חמש זריקות.

- מיקרו-הזרקות צריכות להיעשות בזהירות רבה ובדייקנות כדי להבטיח הזרקה של נפח התאים הנכון, ופגיעה בהזרקה היא מינימלית, ולחץ הפחמן הדו-חמצני צריך להיות אופטימלי כדי למנוע קטלניות של דגים.

- לאחר ההזרקה, לאפשר לדגים להתאושש במשך 10 עד 30 דקות ב 5 מיליליטר של תמיסה טרייה של Danieau המכילה PTU. מעבירים את הדג ל-24 צלחות באר עם מיליליטר אחד של תמיסת ה-PTU של דניאו ודגרים עליהם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר הדגירה, לאחר הרדמת הדגים על פי פרוטוקול הטקסט, יש לשתק אותם על מגלשת זכוכית עם טיפה של 3% מתיל צלולוז.