בדיקת אימונופלואורסנציה: שיטה לזיהוי תאי גידול שנלכדו על חוט רפואי

- קח חוט פונקציונלי עם חלק זהב קטן מצופה הידרוג'ל יחד עם נוגדנים של עניין. טובלים את חלק הזהב של החוט בבקבוקון המכיל תאים סרטניים. סגור אותו עם פקק תיל, ודגר אותו במסובב צינור. תאי הגידול במחזור הדם או CTCs המציגים אנטיגנים על פני השטח נקשרים לנוגדנים שעל החוט. יש לשטוף את החוט על ידי טבילה בבקבוקונים המכילים מלח חוצץ פוספט או PBS ולייבש באוויר. עכשיו לטבול את החוט בתמיסת אצטון כדי לתקן את התאים על ידי ייבוש אותם.

לאחר מכן, הכנס בעדינות את החוט דרך קצה P200 עם החלק הפונקציונלי בתוכו. מלא את הקלטת עם נוגדן מצומד עם fluorochrome כדי לטבול את החוט. נוגדנים מסומנים אלה ייקשרו לאנטיגנים המתאימים שלהם הנמצאים על התאים. אוטמים את הפתח בסרט מעבדה ודגרים לילה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החוט עם PBS כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. הניחו את החוט בתוך מחזיק חוטים וצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. CTCs הקשורים על ידי נוגדנים פלואורס על החוט. בפרוטוקול הבא, נלכוד CTCs על חוט רפואי ונזהה אותם על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית.

- כדי להתחיל את הניסוי, השהה מחדש את כל התוכן של בקבוק T75 שנמצא במפגש של 80% בבקבוקון 5 מיליליטר באמצעות 4 מיליליטר של תווך שלם. לאחר מכן, הסר את החוט מאריזת הזכוכית שלו. טבלו את חלק הזהב הפונקציונלי של החוט לתוך הבקבוקון וודאו שפקק החוט אטום למים מתאים לבקבוקון של 5 מיליליטר. אטמו את החוט בסרט מעבדה. לאחר מכן לדגור את החוט במסובב צינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, שטפו את החוט שלוש פעמים בתמיסת PBS מתקפלת אחת באמצעות שלושה בקבוקונים נקיים שונים והמתינו עד שהחוט יתייבש.

לאחר ייבוש החוט באוויר למשך 10 דקות במכסה מנוע, תקן את התאים על ידי טבילת החוט בתמיסת אצטון 100% בצינור 5 מיליליטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שאין זכר לאצטון בקצה המתפקד. יבשו את החוט באוויר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצינור 5 מיליליטר, לשטוף את החוט פעמיים ב PBS אחד לקפל. לדגור על החוט במאגר דילול נוגדנים.

הכינו 150 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים עם דילול של נוגדן ראשוני חד שבטי מצומד עם פלואורוכרום וחיץ דילול נוגדנים כמפורט בגיליון הנתונים. לאחר מכן השתמש בקצה P200 כדי לחלץ את החוט מפקק החוט והכנס בעדינות את החוט דרך החור הגדול יותר של הקצה. הכנס תחילה את הקצה הלא מתפקד ומשוך את החוט לאט דרך החור הקטן יותר עד שחלק הזהב נמצא ממש מעבר לחור הגדול יותר. הוסיפו בעדינות 150 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לקצה.

כדי למנוע את הסיכון של היווצרות בועות, סובב בעדינות את החוט עד שהקצה המתפקד צולל לחלוטין. אטמו את חור החוד ועטפו את סרט המעבדה סביב החור. לדגור על החוט אנכית במשך הלילה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס. ביום השני, לחסום את הדגירה נוגדנים על ידי שטיפת חוט פעמיים בקפל אחד PBS. הכנס מחדש את החוט לפקק התיל שלו.