מיצוי miRNA: שיטה לחילוץ miRNA מדגימת פלזמה

- מיקרו-רנ"א, או miRNAs, הם רנ"א קטן שאינו מקודד המעורב בבקרת גנים. הבעותיהם משתנות במהלך הסרטן, ולכן הם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן. כדי להתחיל בידוד miRNA, יש לקחת דגימת דם שלמה טרייה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להפריד פלזמה מתאי הדם. העבירו את הסופרנאטנט שוב לצינור וצנטריפוגה טריים כדי לקבל סופרנאטנט פלזמה צלול יותר. לחלץ את supernatant, לטפל עם תמיסת הומוגניזציה צוננת, ואחריו חיץ lysis כדי הומוגניזציה של הדגימה. הוסף תמיסת אנזים פרוטאינאז K כדי לפרק חלבונים, במיוחד את הנוקלאזות שאחרת היו מעכלות RNA במהלך שלבים במורד הזרם.

- לאחר מכן, טען את הליזט לבאר המיועדת של מחסנית מיצוי חומצת גרעין ספציפית למכשיר שהורכב מראש. הוסף פתרון DNase 1 לבאר המתאימה כדי לחסל DNA גנומי מהדגימה. הוסיפו מים נטולי נוקלאז לצינור האלוציה המורכב על המחסנית לצורך ריכוך לפני בידוד miRNA. טען את מכלול המחסנית לתוך מחלץ חומצות הגרעין. בחר והפעל את תוכנת הטיהור miRNA המתאימה. בסיום, הסר את צינור האלוציה המכיל miRNA ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

- בפרוטוקול הבא, אנו מראים מיצוי miRNA מדגימות דם של חולים לצורך בדיקת סרטן ריאות.

- כדי להתחיל פרוטוקול זה, השתמש בצינורות vacutainer כדי לאסוף 10 מיליליטר של דגימת דם שלמה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.

- אין לאחסן דם שלם בטמפרטורה נמוכה, כגון 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הלם תרמי וליזה של תאים המובילים לשחרור מיקרו-רנ"א לא ספציפי.

- צנטריפוגה את הפלזמה תוך שעה כדי להפריד אותה. תוך הקפדה להימנע ממגע עם טבעת הלימפוציטים, מעבירים את הסופרנאטנט לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגו את הסופרנאטנט באותם תנאים. Aliquot 1 מיליליטר של supernatant פלזמה זה לתוך cryovials 1.5 מילימטר, נזהר להימנע איסוף חלק פלזמה מתחתית הצינור. כדי להתחיל בידוד RNA, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת OMG מקוררת מראש ל -200 מיקרוליטר פלזמה עבור כל דגימה. כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה, מערבול במשך 15 עד 30 שניות. כדי להפוך את הדגימה להומוגנית, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ו -25 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לכל דגימה ומערבולת למשך 20 שניות.

- לאחר מכן לדגור את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס ב thermomixer במשך 15 דקות. לאחר מכן, בחר שיטת רקמת miRNA RSC וטען מחסנית עבור כל דגימה על מגש סיפון של מחלץ אוטומטי של חומצות גרעין, כראוי הצבת הבוכנה. העבר את הליזט והוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת DNase 1 למיקומם המתאים במחסנית המכשיר. לבסיס של כל צינור elution, להוסיף 60 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז. כדי להתחיל בטיהור האוטומטי, התחל את הריצה. אחסנו את סך דגימות הרנ"א בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.