אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:08 דק׳ • April 30th, 2023
- טיפול פוטודינמי או PDT הוא סוג של טיפול באור המשתמש בפוטונסיטייזרים - מולקולות המופעלות על ידי אורות באורכי גל ספציפיים. פוטוסנסיטיזר נרגש ממיר חמצן מולקולרי הקיים בתאים למיני חמצן תגובתיים הגורמים למוות תאי. כדי להתחיל את הבדיקה, הכינו מערכת אספקת תרופות רצויה מבוססת ננו-חלקיקים הנושאת את הריכוז המתאים של הפוטונסיטייזר, לבד או בשילוב עם תרופת בדיקה.
הוסף את הריכוז המועדף של תרחיף ננו-חלקיקים זה לתרבית של תאי סרטן ריאות. לדגור על התרבית בחושך לזמן מתאים כדי להקל על ספיגה תאית של ננו-חלקיקים. החלף את המתלים במדיום התרבות הרצוי. לאחר מכן, מקם לייזר סיבים פוטודינמי טיפולי מעל התרבית במרחק אופטימלי המאפשר תאורה אחידה. להקרין את התאים באורך גל מתאים לזמן הרצוי ולדגור במשך הלילה.
החלף את המדיה בתמיסת מדידת ציטוטוקסיות מתאימה. השתמש בקורא מיקרו-צלחות כדי למדוד את כדאיות התא ולכמת את ההשפעות ציטוטוקסיות של הטיפול הניסיוני. תאים מוקרנים המכילים את הפוטונסיטייזר מראים ירידה בכדאיות. בפרוטוקול הבא, נבצע ניתוח פוטוטוקסיות חוץ גופית של היפוקרלין B, פוטונסיטייזר, ופקליטקסל, תרופה אנטי סרטנית, עטופה בננו-חלקיקי חומצה היאלורונית סרמיד בתאי סרטן ריאות A549.
- כדי להתחיל, לסנתז חומצה היאלורונית סרמיד כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לטהר את המוצר באמצעות קרום דיאליזה 3.5 קילודלטון ו lyophilize אותו.
לאחר מכן, הכינו בעצמם ננו-חלקיקי חומצה היאלורונית-סרמיד, ננו-חלקיקי חומצה-סרמיד היאלורונית יחד עם הפוטונסיטייזר, וחלקיקי חומצה-סרמיד היאלורונית עם חומר אנטי-סרטני והפוטונסיטייזר.
זרעו את קו תאי סרטן הריאה A549 לתוך בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות בצפיפות של 1 כפול 10 עד התאים החמישיים בכל באר, ודגרו על התאים במשך 24 שעות. למחרת, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS.
לאחר מכן ממיסים את הננו-חלקיקים המוכנים ב-PBS לריכוז סופי של 2 מיקרומול למיליליטר של הפוטונסיטייזר, היפוקרלין B, על ידי מערבולת.
לתוך ארבע בארות כל אחת, להוסיף 1 מיליליטר של PBS, 1 מיליליטר של חלקיקי חומצה היאלורונית ריקה ceramide, 1 מיליליטר של ננו חלקיקים המכילים photoensitizer, ו 1 מיליליטר של ננו חלקיקים המכילים הן את photoensitizer ואת התרופה נגד סרטן.
בסיום, כסו את הצלחת ודגרו עליה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בחושך כדי לאפשר ספיגה של ננו-חלקיקים לתוך התאים. לאחר מכן להסיר את כל התמיסות ולשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מיליליטר של PBS קר.
חזרו על שלב הכביסה פעם נוספת, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי. לאחר מכן, הניחו את צלחת התרבית בת 24 הבארות מתחת לסיב טיפול פוטודינמי ומקמו את הסיב סנטימטר אחד מהבאר הראשונה.
- המרחק מסיב הטיפול הפוטודינמי לתאים היה הגורם הקריטי במחקר זה. היה חשוב לגלות את המרחק האופטימלי שיכול לכסות את כל התא באור.
- לאחר מכן הרכיבו משקפי בטיחות וכבו את האורות. האר את התאים עם הלייזר בחושך למשך 5 עד 40 שניות כדי להפעיל חמצן סינגלט תגובתי מאוד ורדיקלים חופשיים אחרים בננו-חלקיקים המכילים פוטונסיטייזר.
לאחר חשיפה לאור, יש לדגור על התאים בחושך למשך 24 שעות. לאחר מכן, לשאוף את המדיום תרבית לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS קר. חזור על שלב השטיפה פעם נוספת ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה ו -10 מיקרוליטר של תמיסת מדידת ציטוטוקסיות לכל באר.
לדגור על תאים בתמיסה במשך שעתיים בחושך ולאחר מכן להעביר את כל הדגימות לצלחת 96 באר. מדוד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.