Name: יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: חקור את תפקיד חלבון הלחץ gp96 בהפעלת תאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן בצפרדע Xenopus laevis. השיטה מדגימה הצגה צולבת של אנטיגני עור וגידולים לחקר אימונולוגיה השוואתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חיה המומחה בעלי מסופק על ידי טינה מרטין דייוויד אולברייט מוערכת בהכרת תודה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים T32-AI-07285 (ח&quot;נ), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 מ-NIH.

<ol><li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li>
<li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li>
<li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis%3A+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li>
<li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li>
<li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li>
<li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li>
<li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li>
<li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity%3A+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Xenopus דוחי הוא מודל ייחודי צדדי שאינם יונקים ללמוד חסינות. השימוש הנרחב שלה מחקר ביו החיסונית הניב רבות כלי מחקר חשוב כמו שיבוטים MHC מוגדר LG-6 ו-LG-15 וכן שורות תאים שונות נוגדנים חד שבטיים. השימוש בכלים אלו הקמנו שונים במבחנה מבחני vivo ללמוד את היכולת של הלם החום חלבונים כגון gp96 לתווך חזק Ag ספציפי נגד קטין H-Ag ואנטי הגידול T התגובות תא 7. זו מערכת מודל מאפשרת לנו להמשיך לחקור את המאפיינים החיסונית gp96 תחול במהלך שלבי תא מפעיל. <...

<table><tbody><tr><td>&lt;חזק&gt;ריאגנטים דרושים:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת סליין בופר פוספט למדומיים (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1.15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;אופטימיזציה של היפר-פרמטרים (HPO)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.2 גרם/ליטר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH בריכוז 10N </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריקאין מתאן סולפונט (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100ml</td></tr><tr><td>הפרין מלח נתרן </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול עבור גידולי Xenopus 15/0 [ראו 3 לפרטים נוספים]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום בסיסי Iscove DMEM</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו שאינן חיוניות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטRepartitionימיצין </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>חטיבת המוצרים של Sheffield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-מרקפטו&amp;#8211;אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% מים מזוקקים פעמיים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% סרום עגל עוברי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% שמישרי (supernatant) מקו תאי כליה של Xenopus מדגם A6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% סרום Xenopus רגיל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;חומרים וציוד:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 50 ו-15 מ"ל (סטריליות)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטים סטריליות Precision Glide, מדד 25, אורך 5/8 אינץ'</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מH 18 (Gauge 18)&amp;frac12; מחטי Precision Glide סטריליות</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק טוברקולין סטרילי עם קצה חלק, 1 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי עם קצה חלק (Slip Tip), 10 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (סטריליות)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחית פטרי מ-Polystyrene סטרילית, 60 X 15 מ"מ</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להבי תער</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית למקרוסקופ מסוג Premium, 25 X 75 מ"מ X 1 מ"מ </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלח Petri מזכוכית בקוטר 10 ס"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; פיפטות פסטור Durex מזכוכית בורוסיליקט, חד-פעמיות, עם פקק כותנה</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות Tygon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שתי מלקחות צורפים שוויצריות מס' 5&amp;rsquo;פינצטה</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספרי קפיץ למיקרו-דיסקציה McPherson-Vannas, בעלי קצה חיתוך ישר 6 מ"מ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד-סרט Helios </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ dissection (מיקרוסקופ להשחלה)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאיר בעוצמה גבוהה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>המאסיטומטר (Hemacytometer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיבוי מבער בנזן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;אינקובטור עם ניעור בטמפרטורת C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יחסי in vivo לימוד adjuvanticity gp96 ב הצפרדע xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

פיתחנו את Xenopus דוחי laevis מודל ייחודי שאינם יונקים ללמוד את היכולת של חלבונים מסוימים הלם חום (hsps) כגון gp96 כדי להקל צולבות הצגת אנטיגנים מלווה ומעוררים מולד אדפטיבית התגובות תא T. Xenopus דחיית שתל עור מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד את היכולת של gp96 לעורר קלאסית MHC בכיתה Ia (Ia בכיתה) מוגבלת התגובות תא T. בנוסף, מערכת מודל Xenopus גם מספק חלופה אטרקטיבית כדי עכברים לחקור את היכולת של gp96 ליצור תגובות נגד גידולים יש למטה מוסדר בכיתה Ia שלהם מולקולות ובכך להימלט מעקב החיסונית. לאחרונה, פיתחנו תא המאמצת להעביר assay ב Xenopus באמצעות שיבוטים leukocytes הצפק כמו תאים הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים), וכן הראו כי gp96 יכולה הממשלה CD8 T התגובות תא in vivo נגד אנטיגנים עור קלים histocompatibility כמו גם נגד הגידול Xenopus הרתי 15 / 0 זה לא להביע Ia מולקולות בכיתה. אנו מתארים כאן את המתודולוגיה המעורבים לבצע את מבחני לרבות העברה, התמחרות פועם המאמצת של לויקוציטים הצפק, וכן השתלת עור מבחני השתלת הגידול. בנוסף אנחנו גם המתאר את קצירת והפרדה של לויקוציטים דם היקפיים המשמשים cytometry זרימה מבחני התפשטות המאפשרים אפיון נוסף של אוכלוסיות מעורבות מפעיל דחייה העור אנטי הגידול התגובות.

הצפרדע<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; מספק מודל אטרקטיבי חלופי שאינו לחקר יונקים את היכולת של חלבון הלם חום כגון gp96 לקדם אנטיגן ספציפי CD8 T התגובות התא. אנו מציגים שיטות מחקר<em&gt; In vivo</em&gt; סיוע של המצגת הנגדית של אנטיגנים סרטניים בעור על ידי gp96.

יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis</em

פיתחנו בדו-כלי Xenopus laevis מודל ייחודי שאינו יונקי, במטרה לחקור את היכולת של חלבוני הלם חום (hsps) מסוימים, כגון gp96, ל...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את היכולת השמרנית מבחינה אבולוציונית של חלבון השוק התרמי GP96 לעודד תגובות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בקרפד Xenopus laevis. זאת מושג תחילה על ידי איסוף לוקוציטים פריטוניאליים באמצעות שטיפה פריטוניאלית. השלב השני של ההליך הוא חשיפה (pulsing) של הלוקוציטים הפריטוניאליים ל-GP96 שמקורו בגידול, המשמש כצ'פרון לאנטיגנים מינוריים ולאנטיגני גידול, לאחר דגירה ושטיפות.הלוקוציטים הפריטוניאליים מועברים באופן אדופטיבי באמצעות הזרקה אינטרה-פריטוניאלית לצפרדעים נאיביות, במטרה לחסן צפרדעים אלו נגד גידולים או נגד אנטיגנים של תאירי-התאמה משניים (minor histocompatibility antigens). השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע השתקת עור או חשיפה לגידול בצפרדעים המחוסנות, וניטור הופעת דחיית השתקת העור או הופעת הגידול. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא השגת דם פריפריאלי לצורך אפיון תאי ה-T המעורבים בתגובות דחיית העור והתגובות האנטי-גידוליים.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות האצה משמעותית של דחיית השתלת עור, וכן עיכוב בהופעת גידולים בקרב צפרדעים שעברו priming של GP 96, באמצעות בדיקות השתלת העור ובדיקות חשיפה לגידול, בהתאמה. שלום, אני כריסטינה קוסקה מהמעבדה של ד"ר ז'אק רובר במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר. אני טניה קרוז, גם אני מהמעבדה של ד"ר ריברס.היום נדגים לכם פרוצדורה להטרמה של צפרדעים שיבוטיות באמצעות העברה אדופטיבית של לוקוציטים פריטוניאליים, ולאחריה בדיקות של השתלת עור והשתלת גידולים. בנוסף, נראה לכם כיצד להוציא דם פריפריאלי מבעלי חיים אלו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את יכולתו של חלבון הלם חום GP 96 לעודד תאי CDAT ספציפיים לאנטיגן ב-Xenopus, וכן כדי לחקור את סוגי התאים המעורבים.בסדר, בואו נתחיל. הצפרדעים ששימשו בניסויים שלנו הן שיבוטים איזוגנטיים מהמושבה שלנו באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי לעורר תאי לוקוציטים פריטוניאליים (pls) לצורך איסוף, השתמשו במחט 25 gauge באורך 5/8 כדי להזריק לצפרדע המורדמת באופן אינטraperיטוני תכשיר של e coli שהורג בחום. שלושה ימים לאחר ההזרקה, ה-pls נאספים באמצעות שטיפה אינטraperיטונית.כדי להתחיל בהליך זה, חטאו את בטנו של הצפרדע המורדמת עם כמות קטנה של 70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו במחט 18 gauge בגודל 1.5 כדי להזריק חמישה מיליליטרים של תמיסת סליין פוספט (phosphate buffered saline) סטרילית לדו-מינתיים, או PBS שחומם מראש לטמפרטורת החדר, אל תוך החלל הפריטונאלי. הוציאו את המחול והסעו בעדינות את הצפרדע במשך דקה כדי להבטיח שהבופר המוזרק יתערבב עם הנוזלים בחלל הגוף.בשלב הבא, הכניסו מחט חדשה במידה 18 ובאורך 1.5 ללא מזרק אל תוך בטנו של הצפרדע. תוך הימנעות מכלי דם, אספו את הנוזל הפריטוניאלי שיטפטף מאחורי המחט אל תוך מבחנה קונית נקייה בנפח 50 milliliter. ודאו שאתם שואבים כמה שיותר מהנפח שהוזרק בתחילה לאחר ש-pls נאספו.הניחו את הצפרדע במיכל עם מים רדודים עד להתעוררותה, ואז ניתן להחזירה לכלוב. לאחר איסוף ה-pls, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את ה-sup, natant ובצעו resus. השהו את ה-pls ב-A PBS קר.העבירו את ה-PLS התלוים לתוך מבחנה פלסטיקית (microcentrifuge tube) בנפח 1.5 מיליליטר. כדי לדחוף (pulse) את ה-PLS עם GP 96, הוסיפו את הכמות המתאימה של GP 96 ל-PLS וערבבו באמצעות פיפטור. הדגירו על קרח למשך שעה אחת. לאחר שעה אחת.סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 14, 000 RPM למשך דקה אחת. כדי להסיר GP 96 שאינו קשור, הסירו את העלייה (supernatant). הוסיפו A PBS קר וסבבו מחדש (resuspend).השעה שוב את ה-PLS בצנטריפוגה. שטוף את ה-S ב-A-P-B-S-A קר סך הכל שלוש פעמים כדי להבטיח שלא נשאר G 96 שאריתי לאחר השטיפה הסופית. השעה מחדש את ה-pls הפועמים בריכוז של 5×10⁵ pls ל-300 µL של PBS לצורך העברה אדופטיבית של pls למקבלי LG six נאיביים.הזריק באופן תוך-פעריטוני 300 µL של pulsed pls לכל חיה. יש להכין את הצפרדעים לפחות שלושה ימים לפני ניסויי השתלת העור או חשיפה לגידול, שיוצגו בהמשך. העור להשתלה מופק מצפרדע תורמת מסוג LG 15 תחת הרדמה.השתמשו במספריים כדי לחתוך ולהסיר פיסה קטנה של עור בטני, זהו עור הבטן הנראה כסוף. בשל נוכחותם של ARI ארבעה תאים פיגמנטריים בעת טיפול בשתל. חיוני לצמצם ככל האפשר את המניפולציה של הרקמה, מכיוון שדבר זה יגרום לנזק לשתל.החזיקו את העור בעדינות רבה בעזרת פינצטה והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS קר. השאירו את צלחת הפטרי על קרח. הניחו את העור על זכוכית כיסוי נקייה והשתמשו בתער כדי לחתוך שתלים בודדים לחתיכות של 5 mm על 5 mm.שמרו את השברים ב-PBS על קרח לצורך השתלת העור בקרפדה המקבלת LG six. ראשית, בצעו חתך קטן בעור הגבי של המקבל המורדם. לאחר מכן, הכניסו את השתל בגודל 5 מילימטר על 5 מילימטר תחת העור, כאשר הצד הכסוף פונה כלפי מעלה.יש להקפיד לסמן את סימני המספריים והפינצטה על הש transplanted grafts, מכיוון שסימנים אלה אינם נחשבים כדחייה של הש transplanted graft. כאשר שלב הניקוד מתחיל 24 שעות לאחר מכן, יש להסיר חלק מעור המארח המכסה את ה-graft. השתמשו במספריים כדי לגזור "חלון" מסביב ל-graft, כך שניתן יהיה לראות את ה-graft באופן חופשי.הקפידו לא לגעת בעור התור ולא לגרום לדימום. התחילו ברישום השתל מיד על ידי ביצוע שרטוט. השתלת עור.הדחייה נקבעת על פי אחוז ההרס של ה-aridol על העור המושתר. יש לבדוק את השטרset בכל יומיים עד שלושה ימים תחת מיקרוסקופ סטריאו. הכינו תאי גידול להשתלה על ידי תליה (resus), כאשר הם מושעים במצע גידול לתאים סרטניים בצפיפות של 5x10⁵ תאים ל-300 µL.השקיעו את התאים באמצעות הזרקה תת-עורית בצד אחד של הגב של בעל החיים. לכל צפרדע מוזרקים 5×10⁵ תאים בנפח של 300 µL. צמיחת הגידול תחל בתוך שבועיים עד שלושה שבועות לאחר השבאת הגידול.שימו לב למראה הראשוני של הגידול. השתמשו בקליפרים למדידת ממדי הגידול ורשמו את נפחו מדי יומיים עד שלושה ימים לפני איסוף לוקוציטים מדם הצפרדע. הכינו מחטים מזכוכית על ידי משיכת pasta peppes מעל להבה.לאחר השחזת הקצה העדין של הפיפטה תחת מיקרוסקופ סטריאו, חברו את הפיפטה לצינור שאיפה מפלסטיק. כדי להתחיל באיסוף הדם, גזרו את העור מעל הרגל האחורית של הצפרדע המורדמת כדי לחשוף את וריד הטרסוס הגבי (dorsal tarsus vein). מלאו את מחט הזכוכית ב-1 עד 2 מיליליטר של תמיסת PBS קרה מאוד עם הפרין.לאחר מכן, הכניסו את מחט הזכוכית לווריד והתחילו לאסוף דם על ידי שאיבה איטית באמצעות הפה. ניתן להשיג בין 1 ל-2 מיליליטר של דם מצפרדע ממוצעת בגודלה. אין צורך לתפור את החתך הקטן ברגל הצפרדע.הפצע יחלים בתוך שבוע. כאן מוצגות תוצאות של ניתוח במיקרוסקופ סטריאוסקופי של דחיית השתלת עור 12 ימים לאחר ההשתלה. צפרדע LG six משובטת שקיבלה השתלת עור מתורם LG six בעל MHC זהה לא הראתה דחייה.הכוכבית מציינת את פינצטת הסימון שאינה מעידה על דחייה. לעומת זאת, צפרדע משובטת מסוג LG six שקיבלה השתקה של עור מתורם לא-קרוב גנטית (outbred) עם MHC שונה, מראה דחייה של 80%. בשתי התמונות, החיצים מצביעים על תאי פיגמנט כסופים (silvery iridophores) המסמנים רקמת השתקה בריאה שאינה נדחית.בניסוי הבא, הזרקו ל-LG 15 פולסים של PBS כביקורת שלילית, או של GP 96 רקומביננטי שנוקה מתרבית e coli, או של GP 96 שנוקה מתאי רקמת גידול מסוג 15 zero. לאחר מכן, ביצעו העברה אדופטיבית של תאים אלו לנמעני LG 15 בוגרים, ושלושה ימים לאחר מכן הושתלו תאי גידול 15 zero חיים באמצעות הזרקה תת-עורית. נעקב אחרי הגידולים שהופיעו לראשונה מספר ימים לאחר האתגר, וגודל הגידול נמדד באופן תקופתי. בגרפים אלו, כל עקומה מייצגת את קינטיקת גדילת הגידול בצאבענק אחד. התוצאות מראות כי בבעלי חיים שקיבלו טיפול מקדים של 0.5 או 1 µg של GP 96, הופעת הגידול הייתה מושהית באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות הביקורת. לכן, GP 96 מקדם הצגה צולבת של אנטיגנים של גידולים ב-Xenopus.כך הדגמנו כיצד לבחון את היכולת של GP 96 להציג הן אנטיגנים מינוריים והן אנטיגנים של גידולים בקרפדה *Xenopus laevis* באמצעות השתקת עור ובדיקות של השתלת גידולים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מאיסוף שטיפת פריטונאום אם נגרם נזק לכלי דם, מכיוון שמרבית התאים במקרה זה הם תאי דם אדומים ולא מקרופאגים. כמו כן, חשוב להימנע מלחיצת רקמה עם הפינצטה בעת מניפולציה של השתקת העור כדי למנוע נזק.זהו זה. תודה על השטיפה ובהצלחה בניסויים שלכם.

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את הניקוד אינדוקציה קליני במודל חיה של טרשת נפוצה: כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית התובע חולדות. המחלה, הנגרמת על ידי חולדות מחסנת עם תחליב המכיל חוט השדרה שלם חולדה adjuvant פרוינד של שלמה, מציג סימנים קליניים דומים מחלות אנושיות.

אינדוקציה ניקוד קליני כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

סרטון זה מדגים טכניקת הומוגניזציה יעילה ליצירת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) במודל מורין. התחליב מכיל אנטיגן עצמי - גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) - בשלב המים, מוקף בשלב שמן רציף הכולל חיידק פתוגני בלתי פעיל. האמולסיה מבטיחה שחרור מתמשך של אנטיגנים לתגובה חיסונית ממושכת.

הכנת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

הפיתוח של אינטרפרון-גמא ELISpot וזמינותו של שפן PBMCs מאפשרת אפיון T-cell תגובות במודל זה מאוד רלוונטי ללימוד מחלות זיהומיות. לנו יש להחיל וזמינותו כדי למדוד את תא T תגובות המשויכות intradermal משלוח של חיסונים DNA.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג'ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.

במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium  paratuberculosis שהומת בחום.

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

חקור את תפקיד חלבון הלחץ gp96 בהפעלת תאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן בצפרדע Xenopus laevis. השיטה מדגימה הצגה צולבת של אנטיגני עור וגידולים לחקר אימונולוגיה השוואתית.

יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis

גלה סרטונים נוספים