יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis
16 בספטמבר 2010
הצפרדע Xenopus laevis מספק מודל אטרקטיבי חלופי שאינו לחקר יונקים את היכולת של חלבון הלם חום כגון gp96 לקדם אנטיגן ספציפי CD8 T התגובות התא. אנו מציגים שיטות מחקר In vivo סיוע של המצגת הנגדית של אנטיגנים סרטניים בעור על ידי gp96.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את היכולת השמורה אבולוציונית של חלבון ההלם התרמי GP96 לקדם תגובות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בקרפדה *Xenopus laevis*. מטרה זו מושגת תחילה על ידי איסוף לוקוציטים פריטוניאליים באמצעות שטיפה פריטוניאלית. השלב השני של הפרוצדורה הוא חשיפה (pulsing) של הלוקוציטים הפריטוניאליים ל-GP96 המופק מגידול, המשמש כצ'פרון לאנטיגנים מינוריים ולאנטיגני גידול, לאחר דגירה ושטיפות.
הלוקוציטים הפריטונאליים מועברים באופן אדופטיבי באמצעות הזרקה אינטרה-פריטונאלית לצפרדעים נאיביות, במטרה להכשיר צפרדעים אלו נגד גידולי סרטן או נגד אנטיגנים של תאימיות זעירה (minor histocompatibility antigens). השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע השתלת עור או חשיפה לגידול בצפרדעים שהוכשרו, ומעקב אחר תחילת הדחייה של השתלת העור או הופעת הגידול. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא השגת דם פריפריאלי לצורך אפיון תאי ה-T המעורבים בתגובות הדחייה של השתלת העור ובתגובות האנטי-גידוליות.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות האצה משמעותית של דחיית הש Transplant של עור, כמו גם עיכוב בהופעת הגידול בצלענים שעברו priming עם GP 96, באמצעות בדיקות השתלת העור ובדיקת חשיפה לגידול, בהתאמה. שלום, אני כריסטינה קוסקה מהמעבדה של ד"ר ז'אק רוברט במחלקה למיקרוביולוגיה ואימנולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר. אני טניה קרוז, גם אני מהמעבדה של ד"ר ריברס.
היום נדגים לכם פרוצדורה להסנסת צפריות שיבוט באמצעות העברה מאמצת של לוקוציטים פריטוניאליים, ולאחריה בדיקות של השתתת עור והשתת גידולים. בנוסף, נראה לכם כיצד להוציא דם פריפריאלי מבעלי חיים אלו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את היכולת של חלבוןe GP 96 להגביר תאי CDAT ספציפיים לאנטיגן ב-Salla, וכן כדי לחקור את סוגי התאים המעורבים.
בסדר, בואו נתחיל. הצפרדעים ששימשו בניסויים שלנו הן שיבוטים איסוגנטיים (ISO genetic) מהמושבה שלנו באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי לגרום להגעת לוקוציטים פריטוניים או PLS לצורך איסוף, השתמשו במחט 25 gauge באורך 5/8 להזרקה אינטרה-פריטונית לצפרדע המורדמת של תמיסת E. coli שהורגה בחום. שלושה ימים לאחר ההזרקה, ה-PLS נאספים באמצעות שטיפה פריטונית.
כדי להתחיל בפרוצדורה זו, חטא את בטן הצפרדע המורדמת בכמות קטנה של 70% ethanol. לאחר מכן, השתמש במחט 18 gauge בגודל 1.5 כדי להזריק חמישה מיליליטרים של sterile amphibian phosphate buffered saline, או PBS שחומם מראש לטמפרטורת החדר, אל החלל הפריטוני. הוצא את המחט ועס את הצפרדע בעדינות למשך דקה כדי להבטיח שהבופר המוזרק יתערבב עם הנוזלים בחלל הגוף.
בשלב הבא, הכניסו לבטן הצפרדע מחט חדשה במידה 18 ובאורך 1.5, ללא מזרק. תוך הימנעות מכלי דם, אספו את הנוזל הפריטונאלי שיטפטף מהחלק האחורי של המחט אל תוך מבחנה קונית נקייה בנפח 50 milliliter. ודאו שאתם שואבים כמה שיותר מהנפח שהוזרק בתחילה לאחר ש-pls נאספו.
הנח את הצפרדע במיכל עם מים רדודים עד שתתעורר, ובשלב זה ניתן להחזירה לכלוב שלה. לאחר קצירת ה-pls, בצע סבוב במ centrifuge במהירות של 1000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסר את ה-sup, natant ו-resus. השהה את ה-pls ב-A PBS קר.
העבר את ה-PLS שהושעה למבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 מיליליטר. כדי לדחוס (pulse) את ה-PLS עם GP 96, הוסף את הכמות המתאימה של GP 96 ל-PLS וערבב באמצעות פיפטינג. הדגר על קרח למשך שעה אחת. לאחר שעה אחת.
סבב את התאים בצנטריפוגה ב-14,000 RPM למשך דקה אחת. כדי להסיר GP 96 שאינו קשור, הסר את הנוזל העליון (supernatant). הוסף A PBS קר וערבב שוב (resuspend).
השעה שוב את ה-PLS בצנטריפוגה. שטוף את ה-S ב-A-P-B-S-A קר סך הכל שלוש פעמים כדי להבטיח שלא נותר G 96 לאחר השטיפה האחרונה. השעה מחדש את ה-pls הפועם בריכוז של 5×10⁵ pls ל-300 µL של PBS כדי להעביר את ה-pls באופן אדופטיבי לנשאי LG six נאיביים.
הזרק תוך-פריטונאלית 300 µL של pls בפולסים לכל חיה. יש להכין את הצפרדעים לפחות שלושה ימים לפני ניסויי השתלת העור או אתגרי הגידול, שיוצגו בהמשך. העור להשתלה נלקח מצפרדע תורמת מסוג LG 15 תחת הרדמה.
השתמשו במספריים כדי לגזור ולהסיר חתיכה קטנה של עור ונטרלי (ventral skin), שהוא עור הבטן הנראה כסוף. עקב נוכחות ARI, יש לשים לב לארבעה תאים פיגמנטריים בזמן הטיפול בשתומה. חשוב לבצע מינימום מניפולציות ברקמה, שכן הדבר יגרום לנזק לשתומה.
החזיקו את העור בעדינות רבה בעזרת פינצטה והניחו אותו בתוך צלחת פטרי המכילה A PBS קר. השאירו את צלחת הפטרי פתוחה. הניחו את העור על זכוכית כיסוי נקייה והשתמשו בתער כדי לחתוך השתמרים בודדים לחתיכות של חמישה מילימטר על חמישה מילימטר.
שמרו את הפסגמנטים ב-PBS על קרח לצורך השתלת העור בתוך צפרדע מקבלת LG six. ראשית, בצעו חתך קטן בעור הגבי של המקבל המורדם. לאחר מכן, הכניסו את השתל בגודל 5 מילימטר על 5 מילימטר מתחת לעור, כאשר הצד הכסוף פונה כלפי מעלה.
הקפידו לסמן את סימוני המספריים והפינצטה על השפהים, שכן אלו אינם נספרים כדחייה של השפה. ברגע שתהליך החריצה יתחיל 24 שעות לאחר מכן, יש להסיר חלק מעור המארח המכסה את השפה. השתמשו במספריים כדי לגזור חלון מסביב לשפה, כך שניתן יהיה להשקיף עליה בחופשיות.
הקפידו לא לגעת בעור התור ולא לגרום לדימום. התחילו בסימון השט Transplant מיד באמצעות שרטוט. השתלה של עור.
הדחייה נקבעת על פי אחוז ההרס של ה-aridol בעור המשת transplanted. יש לבחון את השתל בכל יומיים עד שלושה ימים תחת מיקרוסקופ סטריאו. הכינו תאי גידול להשתלה על ידי ריסוף, תוך תליה של התאים במצע תרבית גידולים בצפיפות של 5×10⁵ תאים ל-300 µL.
השתילו את התאים באמצעות הזרקה תת-עורית בצד אחד של הגב של בעל החיים. לכל צפרדע מוזרקים 5×10⁵ תאים בנפח של 300 µL. צמיחת הגידול תתחיל תוך שבועיים עד שלושה שבועות לאחר התגרות הגידול.
שימו לב למראה הראשוני של הגידול. השתמשו בקליפרים כדי למדוד את ממדי הגידול ורשמו את נפחו בכל יומיים עד שלושה ימים לפני איסוף לוקוציטים מדם הצפרדע. הכינו מחטים מזכוכית על ידי מתיחה של פסטה פפס (pasta peppes) מעל להבה.
לאחר השחזת הקצה הדק של הפפיטה תחת מיקרוסקופ סטריאלי, חברו את הפפיטה לצינור שאיבה מפלסטיק. כדי להתחיל באיסוף הדם, חתכו את העור מעל כף הרגל האחורית של הצפרדע המורדמת כדי לחשוף את וריד הטרסוס הגבי (dorsal tarsus vein). מלאו את מחט הזכוכית ב-1 עד 2 milliliters של תמיסת PBS קרה בקרח בתוספת heparin.
לאחר מכן, הכניסו את מחט הזכוכית לווריד והתחילו לאסוף דם באמצעות שאיבה איטית בעזרת הפה. ניתן להוציא 1 עד 2 מיליליטר של דם מצפרדע בגודל ממוצע. אין צורך לתפור את החתך הקטן ברגל הצפרדע.
הפצע יירפא תוך שבוע. כאן מוצגות תוצאות של ניתוח במיקרוסקופ סטריאואופטי של דחיית השתלת עור 12 ימים לאחר ההשתלה. צפרדע LG six משובטת שקיבלה השתלת עור מתורם LG six עם MHC זהה לא הראתה דחייה.
הכוכבית מצביעה על פינצטת סימון שאינה נובעת מדחייה. לעומת זאת, צפרדע משבוטת LG six שקיבלה השתלה של עור מתורם בעל MHC שונה (outbred) מראה 80% דחייה. בשני התמונות, החיצים מצביעים על תאי פיגמנט כסופים (silvery iridophores) המסמנים רקמה מושתלה בריאה שאינה נדחית.
בניסוי הבא, תאי LG 15 הופולסו באמצעות PBS כביקורת שלילית, GP 96 רקומביננטי שנוקה מתרבית e coli, או GP 96 שנוקה מתאי רקמה של גידול 15 zero. לאחר מכן, תאים אלו הועברו באופן אדופטיבי לנרשפי LG 15 בוגרים, ושלושה ימים לאחר מכן הושתלו תאי גידול 15 zero חיים באמצעות הזרקה תת-עורית. הגידולים שהופיעו לראשונה מספר ימים לאחר ההאתגר נוטרו, וגודל הגידול נמדד באופן מחזורי. בגרפים אלה, כל עקומה מייצגת את קינטיקת גדילת הגידול בצבנחן אחד. התוצאות מראות כי בבעלי חיים שקיבלו טיפול מקדימה של 0.5 או 1 µg של GP 96, הופעת הגידול הייתה מושהית באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות הביקורת. לפיכך, GP 96 מקדם הצגה צולבת (cross presentation) של אנטיגנים של גידולים ב-xenopus.
הראינו לכם כיצד לבחון את היכולת של GP 96 להציג הן אנטיגנים מינוריים והן אנטיגנים של גידולים בקרפד *Xenopus laevis* באמצעות בדיקות של השתקת עור והשתלת גידול. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מאיסוף שטיפות פריטוניאליות אם כלי דם ניזוק, כיוון שמרבית התאים יהיו אריתרוציטים ולא מקרופגים. כמו כן, חשוב להימנע מלמעוך את הרקמה באמצעות הפינצטה בעת מניפולציה של השתקת העור כדי למנוע נזק.
זהו זה. תודה על השטיפה ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידה של חלבון הלם החום gp96 בקידום תגובות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בקרפדה מהמין Xenopus laevis. השיטות המוצגות מקלות על חקירת הצגה צולבת (cross-presentation) של אנטיגנים מהעור ומגידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה השוואית
רקע
- חלבון הלם חום (Heat shock proteins) הוא חיוני לתגובות חיסוניות.
- Xenopus laevis משמש כאורגניזם מודל שאינו יונקי.
- הבנת תגובות תאי T יכולה לספק מידע רב לאימונותרפיה של סרטן.
- הצגה צולבת (Cross-presentation) היא מפתח להפעלה יעילה של תאי T.
מטרת המחקר
- לבחון את השימור האבולוציוני של gp96.
- להעריך את תפקידו בהפעלה של תאי CD8 T.
- להעריך תגובות חיסוניות לאנטיגנים של גידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף לוקוציטים פריטוניאליים באמצעות שטיפה פריטוניאלית.
- חשיפה פולסית של הלוקוציטים ל-gp96 המופק מגידולי סרטן.
- העברה אדופטיבית של לוקוציטים לצפרדעים נאיביות.
- ניטור דחיית הש transplanted skin graft או הופעת גידולים.
תוצאות עיקריות
- הצלחה בחסון ראשוני (priming) של צפרדעים כנגד אנטיגנים של גידולים.
- תצפית על דחייה של השתקת עור בצפרדעים שעברו חסון ראשוני.
- אפיון של תאי T המעורבים בתגובות חיסוניות.
- תובנות לגבי תפקידו של gp96 בהפעלה של תאי T.
מסקנות
- gp96 מקדם ביעילות תגובות של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- Xenopus laevis הוא מודל בעל ערך למחקרים אימונולוגיים.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של אימונותרפיה לסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה של Xenopus laevis מספק מערכת שאינה יונקית להערכת הצגת אנטיגן המתווכת על ידי gp96 והגברה (priming) של תאי T, ובכך תומך בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של פיתוח אימונותרפיה. הבדיקה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של gp96 כסייען (adjuvant) על ידי הדגמת יכולתו להגביר תגובות של תאי CD8 T נגד אנטיגנים של גידולים in vivo. התוצאות מספקות בסיס להחלטות go/no-go על ידי קישור הפעילות של הסייען לתוצאות חיסוניות מדידות, כגון השהיה בהופעת הגידול ודחייה מואצת של השתלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההשערה הטיפולית ש-gp96 מקדם הצגה צולבת (cross-presentation) של אנטיגנים המלווים על ידי צ'פרונים כדי לעורר תגובות של תאי CD8 T.
- ערך תפעולי: משתמש בהעברה מאסטיבית (adoptive transfer) של לוקוציטים פריטוניאליים כדי לתקף באופן פונקציונלי את הפעילות של gp96 במערכת חיה.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כך שמראה כי gp96 יכול להתגבר על בריחה חיסונית של גידולים המתרחשת באמצעות דה-רגולציה של MHC class Ia.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות באמצעות דירוג דחייה של השתלת עור וקינטיקה של צמיחת גידול לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי priming ו-challenge הניתנים לשחזור תוך שימוש בלבקוציטים פריטוניאליים כ-APCs.
- ערך מדעי: מאפשר השוואה מקבילה של מקורות gp96 (רקומביננטי לעומת נגזר גידול) לצורך זיהוי המועמד המוביל.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- ערך מדעי: תואם לרלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות לאנטיגן של גידול בהקשרים של חסר ב-MHC class Ia.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה רציפה מאיסוף לוקוציטים ועד לאפיון התאים האפקטורים באמצעות ניתוח דם פריפריאלי.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי הקשר בין מינון של gp96 לבין הופעה מאוחרת של הגידול.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת הערכה איטרטיבית של חומרים אימונומודולטוריים.
- ביולוגיה של גילוי: בחינת היפותזות מכניסטיות לגבי הצגה צולבת של אנטיגנים והפעלת תאי T באמצעות מדדים in vivo.
- סריקה: אספקת תוצאות כמותיות וסטנדרטיות (% דחיית השתלה, זמן השהייה של הגידול) להשוואת מועמדים לאדג'ובנטים.
- אנליטיקה: מאפשרת ביצוע ציטומטריה של זרימה ובדיקות פרוליפרציה של לוקוציטים בדם פריפריאלי לאפיון אוכלוסיות אפקטוריות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תרחישים של חמיקה חיסונית של גידולים.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת וריאנטים של gp96 או שילובים של אדג'ובנטים על פני סוגי אנטיגנים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד העזר (adjuvant) על ידי קישור פעילות מולקולרית לתוצאות תפקודיות של תאי T.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד לוקוציטים, דופק (pulsing) והעברה לצורך עיגון חיסוני (immune priming) הניתן לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות in vivo להפעלה חיסונית ספציפית לאנטיגן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מבנים מבוססי gp96 בהתאם לסיכון, על בסיס מדדי השהיית התפתחות הגידול (tumor challenge delay).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול Xenopus, שטיפת פריטונאית וטכניקות של העברת תאים אדופטיבית (adoptive cell transfer).
- תלוי בגישה ל-PBS סטרילי עבור דו-מינים, תכשירים של אנטיגן gp96, ותורמים של גידולים או השתלות עור.
- מחייב דירוג סטנדרטי של דחיית השתלה ומדידת גידול לצורך השוואה בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למודלים של אנטיגנים אחרים או למקורות לוקוציטים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בקרפדות קלונאליות עם MHC מוגדר כדי לפרש במדויק את קינטיקת הדחייה והגידול.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:24
Introduction
2:12
Elicitation and Harvest of Peritoneal Leukocytes (PLs)
3:43
Pulsing and Adoptive Transfer of LG-6 PLs into Naive LG-6 Recipients
5:20
Skin Graft Assay
7:14
Tumor Transplantation Assay
7:56
Collecting Blood Leukocytes
8:58
Skin Graft and Tumor Transplantation Results
10:34
Conclusion
