תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

שלום, שמי מרקוס. אני עובד עם פרופסור רומן סטוקר במחלקה להנדסה אזרHית וסביבתית ב-MIT, ואני אראה לכם כיצד להכין מיקרו-ערוץ באמצעות טכניקת צילום עצמי. כדי להתחיל, עלינו לתכנן מסכה.

זהו המסך, שמהווה למעשה את העיצוב הסופי של המיקרו-תעלה שאנו מתכוונים לייצר. זהו עיצוב של מזריק, כך שנוכל ליצור שכבה דקה של חומרי הזנה שבה נניח מיקרואורגניזמים השוחים סביבה ונראה כיצד מתבצעת הכימותקסיס, וזוהי תעלה בעלת חלל צדדי ליצירת מיקרו-מערבולת בתוך החלל, ובסרטון שיוצג מאוחר יותר נראה זאת. לאחר קבלת המסך, ניקח את הפרוסות לחדר הנקי ונניח אותן על צלחת פטרי. כעת אנו פונים אל החדר הנקי.

כעת, לאחר שהמסכה הודפסה והיא מוכנה, אנו נמצאים בחדר הנקי כדי לבצע את המיקרו-פבריקציה בפועל. מה שאעשה כעת הוא לקחת חתיכה מהוופר הנקי שרכשתי acabado, ואני רוצה לוודא שהוא נקי במיוחד באמצעות שלושת הממיסים הבאים. השלב הראשון הוא ניקוי באמצעות acetone ולאחר מכן מיד methanol.

ולבסוף, השלב האחרון הוא איזופרופנול. אנו עובדים על הצד המבריק של הפרוסה, שמוכן לציפוי. כעת אני מייבש אותו באמצעות חנקן.

לאחר ייבוש הפרוסה, נכניס אותה לתנור בטמפרטורה של כ-130 °C ונשאיר אותה לאפייה למשך חמש עד 10 דקות. בינתיים, בזמן ההמתנה לסיום אפיית הפרוסה, נוכל להכין שתי פלטות חימום, אחת ב-65 °C והשנייה ב-95 °C. לאחר אפייה של חמש דקות, נוציא את הפרוסה מהתנור ונניח לה להגיע לטמפרטורת החדר במשך כחמש דקות.

כעת אנו מוכנים לציפוי ספין (spin coating). לפני מזיגת הפוטורזיסט (photo resist), עלינו לוודא שאין חלקיקי אבק על גביו; אנו משתמשים בחנקן כדי להתיז אותו על גבי פרוסת הסיליקון (wafer). תנועת ההתזה היא מהמרכז החוצה.

כעת אני שופכת את הפוטורזיסט (photo resist) על גבי פרוסת הסיליקון (wafer) זו. נשפוך כמות של כ-3 milliliters. נסו להחזיק את הבקבוק נמוך ככל האפשר כדי שלא ייווצרו בועות בעת שפיכת הפוטורזיסט על גבי הפרוסה.

כעת נמתין דקה אחת בערך להנחת הפוטורזיסט על הגללית לפני שנתחיל בסבב. וכפי שציינתי, אצור ציפוי בעובי של 100 מיקרון. לכן, נגדיר את זמן הסבב הכולל ל-55 שניות וניתן להתחיל בסבב.

ראשית, אנו מנסים להעלות את מהירות הסיבוב מאפס ל-500 RPM תוך חמש שניות ומניחים לו להסתובב למשך כ-10 שניות, כדי שניתן יהיה לראות שהפוטורזיסט מצפה את כל הפרוסה, ולאחר מכן נעלה את המהירות ל-3000 RPM למשך כשבע שניות ונניח לו להסתובב למשך 30 שניות. לאחר ציפוי הפרוסה בפוטורזיסט, אני מניח את הפרוסה על גבי הפלטה החמה ואבצע אפייה רכה (soft bake) ב-65 °C למשך חמש דקות וב-95 °C למשך 20 דקות. לאחר השלמת האפייה הרכה ב-95 °C, אנו מקררים אותה לטמפרטורת החדר, אך לפני כן, נקרר אותה חזרה ב-65 °C למשך כשתיים עד שלוש דקות כדי למנוע ירידה מהירה בטמפרטורה.

לאחר מכן הנחנו את הדגימה בטמפרטורת החדר להתקררות למשך כחמש דקות. כעת אכפיף אותה לקרינת UV, כך שהחלק החשוף יתקשה והחלק שאינו חשוף יישטף מאוחר יותר. זהו השלב שבו אנו משתמשים במסכה, וכפי שניתן לראות, למסכה יש שני חלקים: חלק שקוף וחלק אחר שהוא אטום לחלוטין או שחור בהקשר זה.

כעת אני הולך להניח את המסכה על גבי השבב המצופה. למסכה שאתם מקבלים מחברת ההדפסה יש שני צדדים; אחד מהם הוא הצד שבו מודפס הדיו.

וזהו האזור שבו תרצו להביא למגע עם הפרוסה. כעת אני עומד לחשוף את הפרוסה דרך המסכה לאור UV. ומסיבות בטיחותיות, אלבש את משקפי המגן הללו.

משך זמן החשיפה תלוי ב-SUA שבו משתמשים וכן בעובי השאיפה. לאחר החשיפה, אני מניח את הפרוסה (wafer) על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 מעלות לצורך אפייה חוזרת למשך חמש דקות, ולאחר מכן ב-95 °C למשך 20 דקות. נזכיר כי זמן אפייה זה משתנה בהתאם לעובי הרצוי וכן בהתאם ל-SUA שבו משתמשים.

בשלב זה, נבצע פיתוח של הפרוסה (wafer). פיתוח פירושו הסרה של החלק הבלתי רצוי של הפוטורזיסט (photo resist), כך שרק האזור שנחשף יישאר על הפרוסה. כדי לפתח את הפרוסה ולהסיר את החלק הבלתי רצוי של הפוטורזיסט, נשתמש בחומר פיתוח (developer).

במקרה זה, אני משתמש ב-pomonal acetate כמפתח; אני אשפוך את הממס הזה לתוך כלי זכוכית זה, אניח את הפרוסה ואטবিল אותה בכלי למשך כ-10 דקות. שוב, הזמן משתנה בהתאם לעובי ולממס שבו משתמשים. כעת, לאחר 10 דקות, ניתן לראות שמה שנותר על הפרוסה הוא עיצוב התעלה הרצוי, וכל החלקים המיותרים נשטפו; רק כדי לתת לה שטיפה אחרונה.

אנו משתמשים באותו ממס, כזה שטרם נעשה בו שימוש, באותו polyon acetate, ופשוט מרססים אותו על גבי הפרוסה כדי לשטוף אותה. ולבסוף, כדי להסיר את הממס, אנו משתמשים ב-iso propanol ומבצעים שטיפה. כעת אנו מייבשים אותה באמצעות nitrogen.

כעת יש לכם פרוסה נקייה עם התבנית הרצויה עליה. אנו מכנים זאת "המאסטר" (master). כעת נחזור למעבדה כדי לשפוך PDMS על הפרוסה ולהמשיך בשאר שלבי הפרוצדורה.

כעת חזרנו מהחדר הנקי ויש לנו את ה-master, שהוא בעצם התבנית עבור מה שעומדים להכין. השלב הבא יהיה לשפוך PDMS, שהוא פולימר שיתקשה. כפי שניתן לראות, אם נשפוך פולימר על התבנית הזו, הפולימר יקבל חריצים, ובסופו של דבר, אם נצמיד אותו לפסית זכוכית, הפולימר עצמו יהיה התעלה.

כעת נכין את ה-PDMS. זהו ה-PDMS, שהוא הפולימר, פולידימטילסילוקסן (polydimethylsiloxane). וזהו חומר ההקשיה.

אשפוך את חומר המקשה למבחנה זו ואשפוך את ה-PDMS למבחנה זו ואערבב אותם ביחס של 1 ל-10. בדרך כלל נרצה להשתמש במערבל כדי לערבב את התמיסה באופן הומוגני. בעת הערבוב, נוצרות בועות רבות, והבועות משמשות כסמן המעיד על כך האם הערבבנו את התמיסה או לא.

כעת, לאחר ערבוב ה-PDMS עם חומר המקשה, אנו מוכנים למזוג את התערובת על גבי התבנית (master), שהיא פרוסה (wafer). כדי להבטיח שהפרוסה לא תזוז במהלך המזיגה, קיבענו אותה באמצעות סרט הדבקה. לפני מזיגת תערובת ה-PDMS על הפרוסה, ננסה לנקות אותה ככל הניתן מאבק שייתכן ונערם על פניה.

כעת נפעיל את המדחס כדי לנקות את הפרוסה מאבק. אוקיי, ניתן לראות שב-PDMS ישנן בועות רבות. לכן, נסיר את הבועיות על ידי הנחת הדגם בתוך תא ואקום.

לכן, תהליך השאיבה נמשך בערך 30 דקות כדי להסיר את כל הבועות. לאחר השלמת הסרת הבועות, נוציא את הדגימה ונניח אותה בתנור בטמפרטורה של 65 °C לאפייה למשך 12 שעות לפחות. לאחר 12 שעות, ה-wafer יהיה מוכן לחיתוך.

אשתמש בסכין זו כדי לחתוך את ה-PDMS ולהסיר אותו מהפרוסה (wafer), ולאחר מכן אשתמש במחורר זה כדי לחורר את החורים עבור כניסות ויציאות הפעימות. בעת החיתוך, יש להחדיר את הסכין עד להגעתה לפרוסה, אך אין להפעיל לחץ רב מדי כדי לא לשבור את הפרוסה, ולחתוך מסביב לתעלה. כעת קלפו אותו.

כעת ניתן לראות שזהו התעלה, שהיא התבנית מהוופר. לפיכך ניתן לראות שהם זהים. וכעת תבנית זו נחרטה על פולימר זה, ה-PDMS.

לאחר שהם מדביקים זאת על זכוכית, זה יהיה התעלה עבור הניסוי שלנו. השלב הבא, שהוא חשוב, הוא לזכור לנקב חורים כדי שנוכל להכניס כניסות ויציאות לתוך המיקרו-תעלות לאחר ניקוב החורים במיקרו-תעלות ב-PDMS. לכן השתמשנו בסרט דביק (scotch tape) כדי להדביק את צד התעלה, כלומר במקום שבו נמצא החריץ, ולהדביקו.

והסיבה לכך שאנו מדביקים את התעלה הזו בסרט הדבקה היא כדי להסיר את כל חלקיקי האבק. השלב הבא הוא חיבור בפלזמה. ולפני החיבור בפלזמה, שנבצע במעבדה השנייה, נסיר את הסרט ונחשוף את המשטח שאנו רוצים לחבר, שהוא המשטח הזה יחד עם הפס גלאס, ולאחר מכן נחשוף אותם לפלזמה של חמצן, ובסוף נצמיד אותם והם יתחברו.

שלום, שמי ג'סטין סימור ואני חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה של רומן סטוקר ב-MIT. המחקר שלי מתמקד באקולוגיה מיקרוביילית, ובאופן ספציפי יותר בבחינה של האופן שבו מיקרובים ימיים מסוגלים למצוא אזורי מזון באוקיינוס. אנו משתמשים בטכניקות מיקרופלואידיקה כדי לבחון תבניות מסוג זה.

כעת נשתמש בתעלה שמרכוס הדגים כיצור קודם לכן ואחרי ההדבקה בפלזמה. כעת אנו יכולים להשתמש בה בניסוי מיקרופלואידי. לפני ניסוי זה, עלינו להכין את התשבתיות שבהן נשתמש בניסוי.

בניסוי של היום נבחן כיצד הפיטופלנקטון הימי donella tur electro מסוגל למצוא מוקדים של מזון בקנה מידה מיקרוסקופי. במקרה זה מדובר באמוניום, ואנו נספק לו ריכוז של 100 µM של אמוניום. בניסויים אלו, אנו יכולים להדמיות את מוקדי המזון על ידי הוספת צבע פלואורסצנטי לחומרי ההזנה שאנו מספקים להם.

לכן אנו משתמשים בצבע פלואורסצאין. כאן אני מpipeting פלואורסצאין בריכוז סופי של 100 micromolar לאמוניום, המשמש כחומר המזין. לאחר מכן נוכל להדמיא את חומר המזין תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, דבר המאפשר לנו לבחון כיצד ממתפשט אזור של חומרי מזינים, ולאחר מכן לבחון את תגובת האורגניזמים לאותו אזור של חומרי מזינים.

בניסויי המיקרופלואידיקה, אנו משתמשים במזרקי זכוכית. השלב הראשון הוא להוסיף את התשתיות ואת האורגניזמים למזרקים שבהם נשתמש. השלב הבא הוא להחדיר את הצינורות למערך המיקרופלואידיקה.

ואנו מבצעים זאת על במה של המיקרוסקופ. אנו מניחים את תעלת המיקרופלואידיקה על במת המיקרוסקופ ולאחר מכן מחברים צינוריות לכניסות וליציאות. לאחר מכן אנו מחברים מיכל פסולת ומוודאים שהמיכל מלא עד מחציתו בנוזל, כך שהצינורית במיכל הפסולת שקועה לחלוטין.

דבר זה מאפשר לנו לשמור על לחץ קבוע בתוך התעלה. לאחר מכן, אנו מחברים מזרקים לצינורית המזינה את תעלת המיקרופלואידיקה המכילה את האורגניזמים, שבמקרה זה הם donella, lector, ואת תסבך ההזנה, שבמקרה זה הוא ammonium. לאחר מכן, אנו מכוונים את המיקרוסקופ ובוחנים את תעלת המיקרופלואידיקה במיקום המתאים לפני תחילת הניסויים.

לאחר שהתעלה נמצאת במיקומה, נעבור לצפייה בתעלה באמצעות המצלמה שתוצג במחשב. כעת ניתן לבצע כיוונונים מדויקים יותר של הפוקוס, ולהבחין במזרק שדרכו מוזרנים רכיבי תזונה. המזרק כולל קצה מחט דקה בקוטר 100 µm המובנית בתוך תעלת המיקרופלואידיקה.

ניתן להפיק מדרג של רכיבי תזונה באמצעות הזרקה שלהם. בנקודה זו, לפני תחילת הניסויים, עלינו להסיר בועות אוויר שייתכן שהחדרו למערכת המיקרופלואידיקה. אנו עושים זאת באמצעות מזרק מלא במי ים מלאכותיים, במקרה זה, אותו ניתן לחבר לערוץ המיקרופלואידיקה באמצעות שסתום.

לאחר מכן, נדחף את המזרק כדי להוציא בועות מהערוץ. ניתן להסיר בועות באחת משתי דרכים: על ידי דחיפתן החוצה דרך פתח היציאה באמצעות הלחץ שיוצר המזרק, או על ידי דחיפתן דרך דפנות חומר ה-PDMS, שהוא חדיר לגזים. ברגע שהבועות הוסרו ואנו מוכנים להתחיל את הניסוי, נקבע את קצבי הזרימה המתאימים להזרקה של החומרים אל הערוץ באמצעות משאבת מזרקים.

במקרה זה, אנו משתמשים בקצב זרימה של 2 µL לדקה, השקול לקצב זרימה בתעלה של 266 µm לשנייה. לאחר שקבענו את קצב הזרימה המתאים, נוכל להתחיל את הניסוי על ידי הפעלת הזרימה, שיוצרת פס דק של חומרי הזנה. כך נוכל להדגים את חומרי ההזנה בעת הזרקתם לתעלה מנקודת ההזרקה, על ידי הוספת צבע פלואורסצאין לחומרי ההזנה והדמייתם תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה APF. לאחר מכן, נוכל לבחון את דינמיקת הכתמים על ידי עצירת הזרימה בתעלת המיקרופלואידיקה והדמיית פס חומרי ההזנה שדיפנדו לצדדים ממיקומם המקורי.

לאחר מכן נעבור למיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy) כדי להמחיש את האורגניזמים השוחים בתוך התעלה ולבחון את מיקומם ביחס לכתם המזינים. אנו יכולים לעשות זאת על ידי צילום רצף של פריימים בקצב של 10 פריימים לשנייה, מה שיצור סרטון שבו נוכל להמחיש את האורגניזמים הללו. לאחר מכן, נוכל להמחיש את האורגניזמים השוחים על ידי חישוב הפרשים בזמנים בין שני פריימים בודדים, שבהם פריים אחד מוחסר מהקודם לו, כך שרק האובייקטים הנעים ימוחשו.

כך נוכל להסיר את רעשי הרקע מהתמונות. לאחר מכן, נקליט סרטונים במרווחי זמן קבועים במשך 10 עד 20 דקות לאחר השחרור הראשוני של טלאי ההזנה. באמצעות תוכנה לניתוח תמונות להחלה (superimpose) של מיקומי האורגניזמים מפריים אחד ברצף למשנהו, נוכל לבחון את השינויים במיקומם של אורגניזמים אלה כדי להפיק מידע על מסלולי השחייה שלהם, וממנו נוכל להפיק מידע מפורט יותר על נתוני השחייה שלהם, כולל מהירויות ושינויים בכיוון.

ניסויים אלה אפשרו לנו, לראשונה, לבחון באופן ישיר כיצד מיקרוביים ימיים מסוגלים למצוא ולהפיק תועלת מכתמי רכיבים תזונתיים בקנה מידה מיקרוסקופי. לדבר זה עשויות להיות השלכות חשובות על הדינמיקה הטרופית ומחזורי הרכיבים התזונתיים באוקיינוס. בהמשך לדבריו של ג'סטין, לאופן שבו מיקרואורגניזמים, ובמיוחד חיידקים, מקיימים אינטראקציה עם מקורות המזון שלהם באוקיינוס יכולים להיות השפעות רבות על מחזורים ביוכימיים.

עם זאת, האוקיינוס אינו סטטי, והוא אינו מתוכנן ככזה; קיימים בו תנאי זרימה רבים, כגון טורבולנציה הנוצרת על ידי הרוח או על פני השטח. בקנה המידה של מיקרואורגניזמים, מה שהם חווים אינו באמת את הטורבולנציה הגדולה, אלא את גזירת הזרימה, כאשר השאריות הקטנות ביותר של הטורבולנציה ידועות כערבוליות קולמוגורוב (Kolmogorov eddies). מה שאנו מנסים לעשות כאן הוא לבחון מהן ההשפעות של ערבוליות זו על התנהגות השחייה של מיקרואורגניזמים.

וכדי לעשות זאת, אנו יוצרים תעלה נוספת באמצעות המסה שהראיתי לכם קודם לכן. וישנה, ישנה חלולית במרכז. הרשו לי פשוט לצייר אותה כדי להגדיל את התרשים.

כך נראה התעלה; זוהי המבט מלמעלה, ואנו מזרימים את הזרימה משמאל לימין, ובשל הגזירה נוצר אזור של זרימה חוזרת בתוך החלל הזה. חלל זה מהווה ייצוג של גרף Addis. ניתן להשתמש באותה מערך שג'סטין כבר הסביר קודם לכן; כאשר משאבת המזרק כבויה ולא הפעלתי זרימה, ניתן לראות שהחיידקים שוחים באופן די אקראי ובחופשי בתוך החלל הזה.

ואין אוריינטציה מועדפת. הסרטון שאתם רואים הוא סרטון של הפרשי זמנים, שזו בדיוק אותה טכניקה שג'סטין משתמש בה. כך שכאשר הזרימה מהירה מאוד, כפי שניתן לראות, החיידקים נסחפים הרחק על ידי המערבולת.

ומסלול התנועה של החיידקים עצמם עוקב אחר קו הזרימה של המערבולת. ומה שמעניין יותר הוא המצב הבא, כאשר אנו מפעילים את משאבת המזרקים. אך המהירות אינה גבוהה מאוד.

זה לא מהיר מדי עד כדי כך שהחיידקים אינם מסוגלים להילחם בזה. אך במידה מסוימת, עדיין ניתן לראות בסרטון זה דמיון למערבולת. לפיכך, מהניסוי הזה למדנו שבנוכחות זרימה טורבולנטית חזקה מאוד, החיידקים נתונים לחסדי הזרימה, והם אינם מסוגלים להתגבר עליה.

עם זאת, באזור של טורבולנציה מתונה, הם עדיין מסוגלים לשחות באופן עצמאי.